客户文献分享 | 昆明理工大学陈永昌团队发表DMD治疗新策略：通过MyoAAV-UA激活内源性全长utrophin

MyoAAV-UA激活内源性全长utrophin作为杜氏肌营养不良症的治疗策略

研究概述

2025年3月10日，昆明理工大学的陈永昌教授及其合作团队在Nature Communications期刊发表标题为“Activation of endogenous full-length utrophin by MyoAAV-UA as a therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy”的研究论文。该研究开发了一种基于紧凑型dCasMINI-VPR系统的肌肉靶向utrophin激活系统（MyoAAV-UA），用于治疗杜氏肌营养不良症（DMD）。

研究通过在mdx小鼠和非人灵长类动物中系统性给药，显著上调内源性全长utrophin的表达，改善骨骼肌功能并减缓心脏功能恶化，且效果可持续六个月。此外，该系统在诱导多能干细胞（iPSC）衍生的DMD患者肌管中也能有效上调utrophin及其糖蛋白复合物的表达，显示出良好的治疗潜力和安全性。

导读

杜氏肌营养不良症（DMD）是最常见的儿童期发病的遗传性神经肌肉疾病，影响约每3500至5000名男性活产婴儿中的1名。患有DMD的男孩通常在2至4岁左右开始出现爬楼梯困难和鸭步症状。大多数患者在12岁左右需要依赖轮椅，并在20多岁时因心肺衰竭而面临致命风险。遗憾的是，目前尚无治愈DMD的方法。

 

DMD是由抗肌萎缩蛋白基因（DMD）突变引起的，已发现数千种突变。DMD治疗研究主要集中在恢复抗肌萎缩蛋白的功能。尽管一些策略，如反义寡核苷酸（ASOs）、提前终止密码子和微/迷你抗肌萎缩蛋白基因疗法，已从实验室走向临床，但仍存在患者覆盖范围有限、疗效欠佳、成本高和免疫原性问题。

 

Utrophin与抗肌萎缩蛋白的同源性约为85%。在DMD患者的肌肉中，utrophin在肌膜上重新表达，增强早期肌肉功能。因此，理论上，上调utrophin表达并确保其膜定位被认为是适用于所有DMD患者的有前景的方法。目前，过表达utrophin主要有两种方法：激活内源性全长utrophin和递送外源合成的微utrophin基因或蛋白。尽管通过腺病毒（AVs）或腺相关病毒（AAVs）递送的微utrophin在DMD小鼠和狗中显示出疗效，但尚不清楚截短的微utrophin是否完全复制了全长蛋白的功能。相比之下，激活内源性全长utrophin可能提供功能完整性，适用于所有抗肌萎缩蛋白突变类型和位点，并且具有非免疫原性。

 

在DMD小鼠模型中，药物激活内源性utrophin可减轻肌肉相关症状。小分子utrophin调节剂Ezutromid在1期试验中显示出安全性和耐受性。在2期研究（NCT02858362）中，24周的治疗增加了DMD患者的utrophin表达，并显著减少了肌肉损伤。然而，在48周治疗后，Ezutromid治疗组与安慰剂组之间未观察到显著的临床疗效差异，这可能是由于代谢问题。CRISPR激活（CRISPRa）系统利用失活的dCas蛋白与转录或表观遗传效应因子融合，可以精确上调目标基因，也可用于激活内源性utrophin。

 

然而，由于腺相关病毒（AAV）的有效载荷限制（约4.7 kb），在体内递送第二代dCas9激活剂（如dCas9-VPR/MPH/SAM/SPH/SunTag）具有挑战性。这一限制需要采用双组分递送方法。此外，系统性CRISPRa治疗的可行性、有效性和长期可持续性仍有待探索。为解决这些问题，本研究开发了一种基于dCasMINI-VPR的高效肌肉靶向CRISPR激活剂，并实现了单AAV递送，称为单MyoAAV递送utrophin激活剂（MyoAAV-UA），随后评估了其疗效、安全性和长期可持续性。结果表明，MyoAAV-UA在小鼠、食蟹猴和人类中有效激活了内源性全长utrophin。在Dmd小鼠中，内源性全长utrophin的上调改善了疾病症状，并具有长期疗效；在食蟹猴中表现出效率和安全性；并且在DMD患者诱导多能干细胞（iPSC）衍生的肌管细胞中上调了utrophin糖蛋白复合物（UGC），表明MyoAAV-UA是所有DMD患者的有前景的治疗策略。

 

正文

1. MyoAAV-UA在不同Dmd小鼠模型中有效激活utrophin

为了评估dCasMINI-VPR激活utrophin的效率，作者设计了18-20个位于转录起始位点上游2000 bp的sgRNA，分别靶向小鼠、食蟹猴和人类的Utrn/UTRN基因启动子区域（图1a）。在小鼠神经母细胞瘤细胞（Neuro 2a）、食蟹猴骨骼肌细胞（MSkM）和人类胚胎肾293T细胞（HEK293T）中，使用dCasMINI-VPR系统转染不同sgRNA后，utrophin在所有测试物种中均显著上调。研究表明，使用多个sgRNA靶向同一基因的启动子和增强子区域可以显著增强目标基因的激活效率。作者测试了最有效的sgRNA组合，发现某些sgRNA对（小鼠的M8+M12、猴的Rh13+Rh17和人类的H1+H10）分别实现了3.04倍、8.75倍和3.92倍的utrophin激活水平，显著优于单个sgRNA（图1b-d）。这些结果表明dCasMINI-VPR系统在体外高效激活utrophin方面具有显著优势。

为了实现肌肉组织中内源性utrophin的特异性和高效激活，作者利用SPc5-12启动子（因其对心脏和骨骼肌的特异性）驱动dCasMINI-VPR系统的表达，并结合了针对Utrn/UTRN基因启动子的双sgRNA。通过肌肉特异性的MyoAAV血清型递送整合后的紧凑型载体（4.6 kb），构建了MyoAAV-UA系统（图1e）。作者进一步在两种Dmd小鼠模型（mdx和DmdΔEx50）中评估了MyoAAV-UA激活utrophin的效果。结果显示，mdx小鼠（3.73倍）和DmdΔEx50小鼠（2.43倍）的utrophin蛋白表达显著上调，其mRNA水平在mdx肌肉中比野生型（WT）组高5.29倍，在DmdΔEx50肌肉中高3.75倍（图1i）。免疫染色显示utrophin在肌膜上表达上调，与WT组中抗肌萎缩蛋白的分布相似（图1g）。

 

为了评估MyoAAV-UA的组织特异性和剂量依赖性，作者对2周龄的mdx小鼠进行了系统注射，分别使用生理盐水和不同剂量的MyoAAV-UA（2×10¹² vg/kg、2×10¹³ vg/kg和5×10¹³ vg/kg）。结果显示，骨骼肌和心脏组织中的病毒基因组拷贝数显著高于非肌肉器官，表明MyoAAV-UA具有高度的肌肉特异性。随着剂量从2×10¹³增加到5×10¹³ vg/kg，utrophin表达显著增加，而2×10¹²至2×10¹³ vg/kg之间的增加则不明显。组织学染色显示，5×10¹³ vg/kg剂量对肌纤维形态和纤维化的改善最为显著，因此该剂量被选为后续实验的剂量。

 

在注射后八周，作者对MyoAAV-UA的潜在非靶向效应进行了评估。结果显示，与生理盐水组相比，MyoAAV-mock组和MyoAAV-UA组之间utrophin或其他内源性基因的表达没有显著差异，表明该系统没有显著的非靶向效应。此外，MyoAAV-UA组的utrophin mRNA表达显著高于其他组，证实了其特异性和高效性。

 

这些结果表明，MyoAAV-UA能够以剂量依赖的方式激活内源性utrophin，具有高度的肌肉特异性和无显著非靶向效应。

 

2. 激活内源性utrophin可长期改善mdx小鼠的肌营养不良症状

作者评估了MyoAAV-UA在缓解肌营养不良症状方面的效果。2周龄的mdx小鼠接受5×10¹³ vg/kg的MyoAAV-UA全身注射（图2a）。结果显示，注射后8周，utrophin蛋白在肱二头肌（BB）和膈肌（DIA）中分别增加了3.04倍和3.10倍，mRNA水平在BB中增加了4.21倍，在DIA中增加了2.56倍（图2b-g）。6个月后，MyoAAV-UA组的utrophin表达仍显著高于mdx-生理盐水组，BB增加了1.87倍，DIA增加了1.91倍（图2c-e）。然而，病毒基因组拷贝数和dCasMINI表达水平在6个月时显著下降，表明病毒存在减少。

注射后8周，utrophin在BB、QD和DIA肌肉的肌膜上显著上调（图2h）。这些肌肉表现出炎症细胞浸润减少、中心核肌纤维比例降低、肌纤维排列和完整性改善以及纤维化减轻（图2h-j, n-p）。此外，胚胎肌球蛋白重链纤维显著减少，MuRF1和Desmin水平降低，表明肌肉损伤减少。免疫荧光染色证实utrophin-糖蛋白复合物（UGC）得以恢复，与野生型（WT）组相似，而DGC复合物的标记物未定位于肌膜，表明UGC特异性恢复。

全转录组分析显示，MyoAAV-UA处理组的基因表达谱与WT组非常相似，表明肌肉功能恢复。基因本体（GO）分析显示utrophin上调与肌肉发育、DGC构建和细胞外基质组成的转录本富集密切相关。加权基因共表达网络分析（WGCNA）也显示MyoAAV-UA组与WT组之间存在显著相关性。

治疗后6个月，MyoAAV-UA组的utrophin表达仍显著升高，肌肉损伤标志物CK水平显著下降至WT水平（图2q）。行为学评估显示，MyoAAV-UA组在8周时握力和运动耐力显著改善，并在6个月时持续存在。这些结果表明，MyoAAV-UA能够有效激活utrophin，缓解肌营养不良症状，且具有长期疗效和安全性。

 

3. 激活内源性utrophin减缓mdx小鼠心脏功能恶化

心力衰竭是杜氏肌营养不良（DMD）患者的主要死亡原因之一。作者研究了utrophin激活对心脏功能的影响，分别在MyoAAV-UA注射后8周和6个月分析了心脏。结果显示，utrophin蛋白水平在8周时增加了2.17倍，6个月时增加了1.35倍（图3a, b）。utrophin mRNA水平在8周时增加了4.54倍，6个月时增加了2.26倍（图3c）。免疫荧光染色显示，心肌细胞膜上的utrophin表达在8周时显著增加，并在6个月时持续存在（图3d）。组织学分析显示，MyoAAV-UA处理组在6个月时炎症细胞浸润显著减少，纤维化显著减轻，其形态与野生型（WT）相似（图3e-g）。

作者进一步对给药后6个月的心肌进行转录组分析。结果显示，mdx-MyoAAV-UA组的utrophin表达显著升高（图3h），与WT组相比，差异基因主要富集在病毒受体激活、病毒响应和细胞间黏附相关通路中，表明细胞间连接更加紧密（图3i）。相比之下，mdx-生理盐水组的心肌转录组在心脏过程、心肌收缩和传导相关通路中表现出显著差异。基因集富集分析（GSEA）显示，mdx-生理盐水组与WT组及MyoAAV-UA组之间存在显著差异，而MyoAAV-UA组的基因表达与WT组非常相似（图3j, k）。这些结果表明，MyoAAV-UA介导的utrophin上调显著改善了骨骼肌和心脏的病理和功能，显示出对DMD心脏病变的保护作用。

 

4. MyoAAV-UA在非人灵长类动物中激活内源性utrophin表现出有效性和安全性

在小鼠中常用的1×10¹⁴ vg/kg AAV剂量会导致严重的肝肾损伤和危及生命的并发症。因此，作者基于在小鼠中表现出高效性的5×10¹³ vg/kg剂量，评估了MyoAAV-UA在非人灵长类动物（NHPs）中的安全性和有效性。

实验选用4只1.5岁雄性食蟹猴，其中2只接受5×10¹³ vg/kg的MyoAAV-UA注射，另外2只接受生理盐水（图4a）。基于在HEK293T细胞系中的高效激活效率，作者选择了H1和H10这对sgRNA，它们在人类和NHPs中是相同的，并在食蟹猴骨骼肌细胞中实现了3.32倍的激活效率（图1c）。

注射后4周，GM和BB肌肉中dCasMINI表达显著增加，utrophin蛋白表达分别增加了2.17倍和2.16倍（图4b-d），mRNA表达分别增加了2.96倍和2.97倍（图4e）。免疫荧光染色显示utrophin显著定位于肌膜（图4f），组织学染色表明肌肉形态正常，未检测到CD3+和CD8+ T细胞（图4g），表明utrophin作为内源性蛋白未异常激活免疫系统。

作者进一步评估了MyoAAV-UA的安全性。注射后，所有猴子的骨密度和骨矿物质含量呈上升趋势，未出现显著体重下降或体温异常。血清中干扰素（IFN-γ）水平在注射后第7天上升，第21天达到峰值，第42天恢复正常（图4h）。肝功能指标ALT和AST短暂升高，但均低于500 U/L，并在2周内恢复正常（图4i, j）。血小板短暂下降，1周内恢复正常（图4k）。其他指标如血清肌酐、γ-谷氨酰转移酶、胆固醇和血糖在给药前后均无显著变化。超声检查、脑部MRI和胸部X光均未发现异常。这些结果表明，MyoAAV-UA在NHPs中有效激活utrophin，且未观察到显著副作用。

 

5. 在DMD患者iPSC衍生的肌管细胞中激活utrophin上调UGC

为了评估MyoAAV-UA在DMD患者中的潜在应用，作者从两名携带DMD突变（NM_004006；c.790G>T p.G264* 和 △Exon 49–50）的DMD患者中分离外周血单个核细胞（PBMCs）（图5a），并建立了诱导多能干细胞（iPSCs）（图5b）。H9细胞被用作健康对照。

这些DMD-iPSCs和H9细胞随后被分化为骨骼肌细胞（图5c, d）。作者确定H1和H10这对sgRNA是人类UTRN启动子区域中最有效的组合（图1d）。含有H1和H10 sgRNA的MyoAAV-UA被添加到DMD患者的iPSC衍生肌管细胞中。感染后5天，G264*和△Exon 49-50 iPSC衍生的肌管显示出utrophin蛋白表达显著上调，G264*突变增加了3.45倍，Exon 49–50缺失突变增加了3.79倍（图5e-g）。mRNA水平分别增加了3.63倍（G264*）和4.34倍（△Exon 49-50）（图5h）。免疫荧光染色显示α-肌糖蛋白和γ-肌糖蛋白表达上调，表明在DMD患者的iPSC衍生肌管细胞中恢复了utrophin-糖蛋白复合物（UGC）（图5i, j）。

综上所述，这些发现表明MyoAAV-UA系统在DMD患者iPSC衍生的肌管细胞中有效上调utrophin表达并恢复UGC，显示出潜在的临床应用价值。

 

讨论

以往用于激活基因表达的策略，包括锌指核酸酶（ZFN）、药物调节剂或其他激活方法，面临着效率低下、设计复杂或靶向特异性差等挑战。尽管dCas9激活方法提供了理想的解决方案，但其较大的尺寸限制了其在腺相关病毒（AAV）载体中的包装能力，且分割使用会显著降低效率。

为解决这一问题，作者开发了MyoAAV-UA系统，该系统采用了dCasMINI-VPR——CRISPRa激活工具的微型化版本，并结合双sgRNA，以实现高效包装在单个AAV载体中进行递送。作者在体外筛选出高效的sgRNA组合，与单个sgRNA相比，显著提高了激活效率。通过利用肌肉特异性启动子（SPc5-12）和MyoAAV血清型，实现了骨骼肌和心肌的靶向激活。与以往的激活系统相比，MyoAAV-UA仅需5×10¹³ vg/kg的剂量即可实现有效的系统性肌肉递送和utrophin激活，从而降低了AAV相关的毒性。此外，与双AAV重建系统相比，该集成系统也提高了效率，突显了其在未来临床转化中的重要价值。

在Dmd小鼠模型中，MyoAAV-UA成功激活了mdx和Dmd△Ex50小鼠中的utrophin，实现了不同突变类型肌肉中的utrophin上调和正确的膜定位。系统给药后，这种上调缓解了肌肉退化和纤维化等肌营养不良症状，且效果可持续六个月。转录组分析显示，utrophin上调与肌肉结构恢复（尤其是在心肌组织中）密切相关。这些发现与近期研究一致，即通过dCas9-VP64激活utrophin可改善DMD患者hiPSC衍生心肌细胞的生理功能。值得注意的是，六个月时心肌中观察到高utrophin表达和显著的病理改善，而未治疗的个体则出现严重的纤维化。鉴于心肌细胞是终末分化细胞，上调的utrophin和心肌病理的恢复可能长期维持。此外，转录组分析表明，utrophin上调不仅与骨骼肌中UGC重建和细胞外基质黏附功能呈正相关，还与心肌中细胞外基质组织和细胞间黏附高度相关。许多DMD患者在后期发展为心力衰竭，这表明该治疗可能延缓心力衰竭的发生并降低死亡率。

作者观察到mdx和Dmd△Ex50小鼠之间utrophin激活效率存在差异，这可能是由于这两种模型中存在不同的DMD基因突变。同样，不同突变类型的DMD患者也表现出utrophin表达的显著差异，其潜在机制尚不清楚。以往研究表明，DMD基因中跨越外显子10-60的大片段缺失可能阻碍utrophin定位于肌细胞膜，导致严重的肌肉萎缩。需要进一步研究以充分理解这些机制。以往的AAV临床试验表明，在高剂量条件下会出现严重的不良反应。超过2×10¹⁴ vg/kg的系统给药剂量会导致肝功能衰竭和死亡，引发安全性担忧。由于非人灵长类动物（NHPs）在遗传、生理和行为上与人类高度相似，是研究人类疾病和测试潜在疗法的宝贵模型，因此在本研究中，作者在NHPs中系统给药MyoAAV-UA，剂量为5×10¹³ vg/kg。结果显示，MyoAAV-UA在食蟹猴肌肉中实现了超过2倍的utrophin激活，且未出现严重的毒性副作用，突显了其在大型动物中的有效性和良好的安全性。在健康的食蟹猴中，utrophin在肌膜上的分布呈散在状，这与肌营养不良小鼠中均匀的肌膜表达形成对比。这种散在的utrophin表达是由于猴子中缺乏肌营养不良病理，肌膜已被抗肌萎缩蛋白占据，因此上调的utrophin仅在肌膜的某些区域出现，导致散在的染色模式。此外，作者还评估了MyoAAV-UA在DMD患者iPSC衍生肌管中的效率，显示出约3.5倍的utrophin上调。与Tejvir S. Khurana等人的发现一致，本研究也表明utrophin过表达导致肌膜上α-肌糖蛋白和γ-肌糖蛋白染色增加，与UGC的改善恢复一致。这些结果展示了MyoAAV-UA在DMD治疗中的临床潜力。

尽管mdx小鼠模型被广泛用于研究DMD，但它未能完全复现人类患者中观察到的进行性肌肉纤维化。特别是与人类DMD患者相比，mdx小鼠的心脏表现较轻。尽管utrophin上调在模型中改善了骨骼肌和心肌，但未来使用更合适的模型（如NHP模型和大鼠模型）的研究将为心脏结果提供更好的见解。作者观察到治疗效果随时间减少，基于这些发现，预计保护性益处也会随时间减少。鉴于6个月在小鼠寿命中是一个相对较长的时期，这一时间框架可能被认为是人类的一个重要的治疗窗口。在未来的研究中，开发增强utrophin表达持久性的策略至关重要。

总体而言，MyoAAV-UA在小鼠、NHP和人类中高效激活全长utrophin。在mdx小鼠中，utrophin上调显著缓解了肌营养不良症状，且在NHP中未观察到显著副作用，突显了MyoAAV-UA作为DMD治疗的有前途的方法，并为其临床转化提供了支持。

派真生物很荣幸为该研究提供了AAV包装服务：