近期Signal Transduction and Targeted Therapy杂志（IF=40.5）上发表了一篇重量级AAV基因治疗综述文章（通讯作者为美国马萨诸塞大学Chan医学院的高光坪教授），深入探讨了AAV基因治疗的最新突破与未来趋势。这篇文章不仅汇聚了行业内的权威观点，更揭示了关键技术的最新动态，为学术界和产业界的创新提供了全新启发。前几章我们分别学习了AAV的基础知识、AAV的载体开发、AAV的生产工艺以及AAV的临床应用，相信大家都有不少收获，下面我们继续深入学习AAV临床应用中存在的免疫原性和应对策略。
rAAV基因治疗临床应用的挑战和局限性
rAAV衣壳的性能与给药方式密切相关，因此需要探索不同的递送方式，以便将其递送至合适的位置。每种递送方式和衣壳的选择都应根据具体的疾病、靶向区域、器官系统，以及患者年龄等因素来确定（表2）。
表2 rAAV不同给药方式的优点和缺点
一个经典的例子是血脑屏障（BBB）的存在，它有效地保护了中枢神经系统，也成为基因治疗需要克服的一个重要障碍。一些rAAV衣壳能够有效穿过血脑屏障。如果治疗的目标仅限于大脑的某个小区域，那么通过静脉注射给药以靶向中枢神经系统就不是最优选择，因为它需要的载体剂量较大，且可能导致较大的副作用，同时无法实现对目标区域的最佳转导。在这种情况下，直接且局部的递送方式至关重要，AADC的治疗案例便是一个典型的例子。然而，即使是在有限的区域内递送，衣壳的选择也必须非常谨慎。比如，rAAV9即便在局部递送时也表现出明显的组织扩散和较广泛的亲和性，而像rAAV2这样的血清型则转导能力较为有限。
另一个挑战是从临床前研究到临床试验的转化。为了降低静脉注射所需的高剂量带来的载体成本和风险，通常采用脑脊液空间给药来实现中枢神经系统的广泛转导。然而，将小鼠、大鼠甚至更大动物的研究结果外推到人类身上面临巨大的挑战。例如，rAAV9在小鼠中能够实现全脑转导，因为小鼠的侧脑室和皮层之间的距离仅为几毫米，而在人类中，这个距离则是几厘米。因此，采用脑脊液递送方式进行广泛的中枢神经系统转导的临床试验，必须证明这种递送方式在人类中的可转化性。
rAAV的免疫原性
除了物理屏障之外，rAAV还面临着免疫系统设立的多重生物屏障，这些包括预存免疫、补体激活、天然免疫模式和危险信号受体，以及适应性免疫中的B细胞和T细胞反应（图6）。在这里，我们将讨论每种免疫屏障如何对载体转导产生负面影响，以及现有的潜在解决方案。
图6 rAAV基因治疗中的免疫反应。a. 预先存在的AAV特异性抗体可能与rAAV相互作用，阻止其进入目标细胞。来自细菌的内肽酶IdeS及其同源物能够将抗体切割成Fab和Fc片段，从而缩短抗体在血液中的半衰期，并消除Fc介导的功能。另外，也可以通过修饰rAAV衣壳或将其包装在外泌体（EVs）中，以防止被抗体的识别。b. 在给予高剂量rAAV时，观察到补体激活现象，其具体机制尚不清楚。主要假设是rAAV与细胞表面结合，通过与补体C1q的相互作用激活经典途径，导致C4和C2裂解形成C3转化酶C4b2b。随后，C3被裂解并形成C5转化酶，裂解C5成C5b，C5b与C6-9结合形成膜攻击复合物（MAC），直接导致细胞裂解，从而引发肝脏或肾脏损伤。补体激活还可能引发内皮损伤、血栓性微血管病（TMA）和非典型溶血性尿毒症综合征（aHUS）。环肽APL-9是C1抑制剂，依库珠单抗则可抑制C1、C3和C5，可能有助于抑制补体激活级联反应。c. 包括TLR2（识别病毒衣壳）、TLR9（识别未甲基化CpG）和RIG-I/MDA5（识别双链RNA）在内的天然免疫受体已被证实能够促进炎症反应。通过一系列信号转导事件，IRF3、IRF7和NF-κB会被磷酸化并转移到细胞核，激活I型干扰素（IFN I）、干扰素刺激基因（ISGs）和促炎细胞因子，进而介导抗病毒免疫和炎症反应。许多信号通路的组成成分可以被药物抑制剂靶向。此外，来自端粒的io2序列（一种哺乳动物端粒来源的ODN TTAGGG重复序列）能够抑制TLR9的激活。d. GOI的表达产物和衣壳可以通过蛋白酶体加工为肽段，随后由MHC-I或MHC-II分子进行呈递。识别这些肽段的CD8和CD4 T细胞将被激活。CD8 T细胞可能会直接杀死rAAV转导的细胞，而CD4 T细胞则可以协助CD8 T细胞和B细胞增强其效应功能。可以特异性识别衣壳的B细胞会释放抗体，可能导致未来重复给药时抗体介导的免疫排斥。通过在GOI质粒中表达盒的3’UTR设计miRNA结合位点，可以与细胞内的miRNA相互作用，导致转录本降解。在抗原呈递细胞中，这种设计可能会阻止转基因来源的肽段被呈递给T细胞。此外，抗CD20抗体利妥昔单抗和mTOR抑制剂雷帕霉素也可用于减少适应性免疫反应。
针对rAAV衣壳的预先存在的体液免疫反应，通常通过rAAV特异性中和抗体（NAbs）来衡量，这些抗体可能源自与野生型AAV的过往接触，形成了免疫记忆。新生儿在出生后的前6个月会携带母体来源的AAV中和抗体。之后，中和抗体的滴度会逐渐下降，但在婴儿7至9个月大时，抗体滴度会再次升高。不同血清型和不同地理区域的血清阳性率差异较大，从低于10%到超过90%不等。对于rAAV基因治疗来说，这种免疫反应是最大的挑战之一，因为即使是低水平的血清阳性反应，也可能显著降低通过静脉给药的载体转基因表达效果。
在与外来抗原积极交战时，一些表达IgG的B细胞会分化为长期存在的浆细胞，这些浆细胞主要驻留在骨髓中，并在感染得到控制后继续产生抗原特异性的IgG。尽管IgM水平在感染结束后会迅速下降，IgG水平却可以保持相当长的时间，成为抵抗感染的主要体液免疫屏障。
NAbs（中和抗体）在再次给药时也是一个巨大的挑战。由于rAAV基因组通常以环状游离基因组的形式存在，它们在宿主细胞每次分裂时会平均减少一半，且在宿主细胞死亡时会丢失。因此，在患者的一生中，特别是对于细胞周期活跃的器官（如肝脏）的基因治疗，可能需要多次给药。然而，重新给药时会受到由第一次给药引发的NAbs的抑制。
基因治疗中rAAV衣壳-抗体的相互作用：在基因治疗中rAAV衣壳与抗体的相互作用尤为关键。通过冷冻电镜（cryo-EM）或肽扫描技术，可以捕捉到抗体与AAV衣壳表面相互作用的互补决定区（即抗体接触抗原的位置）。研究人员已经识别出一些抗原“热点”区域，比如二十面体结构的3重对称轴、5重对称轴以及2/5重对称区域等。在一项针对接受Zolgensma治疗的患者的最新研究中，约75%的抗体与2重表面结合。尽管这些发现有助于指导衣壳改造，以避开由抗体引发的预存免疫反应，但需要注意的是，rAAV相对较小，因此即使少量抗体结合到病毒衣壳上，也足以覆盖其表面并阻止病毒进入细胞。
对局部与系统给药方式的影响：静脉输注最容易受到循环中rAAV特异性抗体的影响。相比之下，局部注射到免疫豁免器官（如眼睛和中枢神经系统）的方式对rAAV特异性抗体的限制较小，并且有可能进行重新给药。尽管玻璃体中的预存中和抗体（NAbs）水平远低于血清中的水平，但玻璃体中的NAb水平与血脑屏障（BBB）的完整性呈负相关关系，这一点在评估眼科基因治疗潜在影响时尤为重要。在接受ADVM-022通过玻璃体内注射的非人类灵长类动物（NHPs）中，注射了一只眼睛后，血清和注射眼睛中均出现了NAbs，但未注射的眼睛中并未出现。两个月后对另一只眼睛进行玻璃体内注射，未导致炎症加重。与第一只眼睛相比，第二只眼睛中的转基因表达趋势较低，但仍在预测范围之内。
有趣的是，针对循环中NAbs的不同敏感性，可能可以作为一种策略，以限制载体在非靶组织中的感染。具体来说，在进行脑内或脑室内注射时，NAbs的存在能够阻止转基因递送到肝脏，但不会阻止其递送到中枢神经系统。
筛选预存免疫：可以通过酶联免疫吸附测定（ELISA）来检测针对rAAV衣壳的总抗体（TAb）水平。为了确定患者是否符合临床试验的入组标准，许多试验采用基于细胞转导抑制（TI）的方法来评估患者血清需要稀释到什么程度才能允许最佳的rAAV感染。有时，血清中可能出现TAb阳性但TI阴性的情况，这表明并非所有AAV特异性抗体都会抑制转导。更有趣的是，有些血清TAb阴性但TI阳性，这意味着血清中存在非抗体的抑制性成分。
逃避预存免疫的策略：CD20是一种在B细胞上高度表达的特异性分子，能够被利妥昔单抗（rituximab）靶向。利妥昔单抗在多个基因治疗试验中与其他免疫抑制剂（如类固醇和雷帕霉素）联合使用，旨在减少全身炎症反应以及B细胞和T细胞介导的免疫反应。然而，利妥昔单抗无法有效预防已有的体液免疫反应，因为长期存活的浆细胞不表达CD20。
在rAAV外面包裹囊泡（EVs）可能有助于部分逃避中和抗体（NAbs）的作用。还可以在EVs表面加载免疫抑制分子，如CTLA-4，从而进一步抑制免疫反应。将rAAV包裹在EVs内部可能改变其对不同组织的趋向性，这可能需要对EV进行额外的修饰，类似于对rAAV衣壳的改造。这也是逃避预存免疫反应的另一种常见方法。
最近，研究者探索了能够切割人类抗体的细菌内肽酶。来自化脓性链球菌的IgG降解酶Imilifadase（IdeS）已被证明能够有效消耗总IgG，并在rAAV血清阳性的非人灵长类动物（NHPs）中显著改善载体转导。来自马链球菌的IdeZ也显示出了类似的效果。此外，IdeXork，一种专有的IgG降解酶，目前正在基于rAAV的迟发性庞贝病临床试验中进行研究。多项研究表明，IdeS型酶能够提供一个5-7天的无IgG窗口期。一个潜在的问题是，IdeS在中和滴度较低时（例如，NHP中AAV3B的中和滴度约为1:108）效果最佳。在一个初始中和滴度为1:696的NHP中，IdeS将滴度降至1:88，这仍然足以抑制转基因表达。此外，针对IdeS的适应性免疫反应可能会降低其效果。借鉴移植研究的经验，二次使用IdeS可能只能提供一个24小时的治疗窗口，因为会产生抗IdeS抗体。
此外，还有来自猪链球菌的IgM切割酶（IceM）和经过工程改造的IceMG，后者能够同时切割IgM和IgG。除了切割血清中游离的IgM/G外，这些酶还能从B细胞表面切割IgM，并阻断rAAV9介导的补体激活。不过，这些酶是否能转化为临床应用仍需要进一步研究。
rAAV输注期间补体激活的具体机制尚未完全明了。AAV2衣壳能够直接免疫沉淀C3及其裂解产物C3b和iC3b，但在体外，当rAAV颗粒的剂量达到1 × 10^14 vg/kg时，在无IgG的混合人类血清中并不会激活C3。体外实验表明，只有当存在抗AAV抗体时，AAV才能在全血中激活补体。多个临床试验观察到接受rAAV治疗的患者体内C4水平下降。此外，最近一项针对接受Zolgensma治疗患者的研究发现，单独接受类固醇治疗的患者表现出更高的TMA发生率，并且AAV9特异性IgM和IgG滴度较高，而同时接受类固醇、利妥昔单抗和雷帕霉素治疗的患者则表现出较低的抗体滴度和最小的补体激活。这些证据似乎表明，rAAV输注中的补体激活是通过经典途径发生的。然而，两个观察结果与这一假设存在一定的冲突，尚未得到充分解释。首先，在AAV初次接触的患者中，即便在rAAV特异性IgM和IgG尚未产生之前，C4水平就已较低。其次，患者在预先筛选时已被被确定为特定AAV血清型阴性。
在rAAV给药后，小鼠和非人类灵长类动物（NHPs）似乎没有表现出在人类中观察到的补体激活特征。在NHPs中，即使AAV特异性IgM尚未出现，也在给药后第3天短暂出现了补体激活，表现为Bb和sC5b-9的增加，而非C4b。在小鼠中，未发表的结果显示，当AAV的剂量达到2.5 × 10^14 vg/kg时，补体激活非常轻微。最近一项在小鼠中的研究表明，当剂量达到3.0 × 10^14 vg/kg时，可检测到血清中的C3b和肝脏中的C5b-9；而在7.0 × 10^14 vg/kg的超临床剂量下，出现了轻度的血小板减少，并且补体激活的峰值出现在给药后的第3天。
补体抑制策略：目前正在测试几种补体抑制剂用于rAAV基因治疗，包括阻断C5的人单克隆抗体依库珠单抗、阻断C3的肽类抑制剂APL-9421以及天然存在的血清蛋白C1酯酶抑制剂（C1-inh）。
依库珠单抗已用于治疗溶血性尿毒症综合征（aHUS），并且也已用于TMA后的基因治疗患者。尽管大多数患者从TMA中恢复，但有一名患者最终因新发的金黄色葡萄球菌表皮炎感染导致急性肾损伤而死亡。依库珠单抗能够降低血清中的sC5b-9并略微增加血小板计数，但未能挽救该患者，因为补体在抗细菌防御中是必不可少的。
由于C3与rAAV衣壳的相互作用促进了小鼠巨噬细胞对病毒的摄取，因此补体抑制可能会影响rAAV的转导效率。体外实验结果证实，APL-9421在NAb高的血清中能够减少人类血液白细胞对rAAV的摄取，但在NAb低的血清中没有此效应。然而， C1-inh在未免疫小鼠和免疫小鼠中分别提高了约33%和28%的肝脏转导效率。
细胞的表面、内质体和细胞质中存在一些被称为天然免疫受体的模式识别受体（Pattern Recognition Receptors，PRRs），它们能够识别病原体相关分子模式（Pathogen-Associated Molecular Patterns，PAMPs），触发免疫应答。这些受体包括Toll样受体（TLRs）、RIG-I（维甲酸诱导基因-I）样受体（RLRs）、NOD样受体（NLRs）等，它们有助于宿主防御微生物感染，特别是对病毒等病原体的识别和响应至关重要。天然免疫受体通常在病原体感染后的几分钟或几小时内被激活。由于rAAV是病毒，它的一些固有特征可能会被这些天然免疫受体识别。天然免疫受体激活后会导致炎症细胞因子的产生，这些因子已被证明显著降低转基因表达，并进一步诱导适应性免疫应答。
已证明与rAAV相互作用的天然免疫受体：已证实与rAAV相互作用的先天受体包括TLR-2、TLR-9、MDA5和RIG-I。TLR-2是一种细胞表面受体，能够识别多种微生物相关的配体，如脂蛋白、肽聚糖和糖脂。TLR-2还可以通过与TLR-1和TLR-6形成异二聚体，进一步扩大其配体识别范围。研究发现，rAAV2和rAAV8通过TLR-2依赖的途径在人体肝细胞中激活了NF-κB介导的细胞因子表达。TLR-9是一种内质体膜附着的受体，负责识别微生物DNA中的未甲基化CpG序列。rAAV激活TLR-9不仅导致下游TLR信号转导介导的细胞因子（如IL-6和TNF-α）的急性表达，还会促使细胞毒性CD8+ T细胞浸润，导致转导细胞的死亡。此外，通过从基于rAAV8的血友病B治疗载体中去除CpG序列，可减少中和抗体的产生。MDA5和RIG-I是细胞质中的dsRNA传感器。rAAV的3′ ITR区域可能具有合成负链RNA的启动子活性，其与正链转录本退火形成双链RNA。人体肝细胞和灵长类视网膜均高表达MDA5和RIG-I，且在体外rAAV感染后能介导IFN-β的产生。
最近的一项研究表明，IL-1受体（IL-1R）-MyD88信号转导是rAAV检测的关键因素。研究发现，IL-1R−/−和MyD88−/−小鼠在注射rAAV8.OVA后并未显示出转基因特异性T细胞反应。IL-1R的配体为IL-1α和IL-1β，这些配体在炎症小体激活后被激活，而MyD88在TLRs和IL-1R的下游发挥作用。有趣的是，缺乏TLR2/3/4/9、NLRP1/3、AIM2或Caspase-1的小鼠表现出正常或仅轻微降低的转基因特异性T细胞反应，表明rAAV可能由未知的天然免疫受体识别到。
减轻天然受体信号传导的策略：为减少TLR-9信号传导，可通过密码子优化去除rAAV载体中的CpG序列。然而，这种方法的一个担忧在于不同tRNA分子的丰度可能存在差异，改变其使用可能会影响蛋白折叠的动态，并增加误折叠的风险。因此，在rAAV生产过程中加入甲基转移酶或许是一个更好的替代方案。另一种选择是添加TLR-9抑制序列。哺乳动物端粒来源的ODN TTAGGG重复序列能够形成G-四联体，可通过与TLR-9结合以抑制其二聚体的形成和信号传导。携带该序列的rAAV在多种动物模型中表现出较低的免疫刺激性，减少了肝脏、肌肉和视网膜的T细胞浸润。
药理学抑制天然免疫信号通路也是一种可行策略。阻断IL-1（炎症小体相关细胞因子）可以降低rAAV衣壳和GOI表达产物特异性CD8+ T细胞的比例，而抑制IL-6（TLR相关细胞因子）则减少了对rAAV衣壳的抗体反应。此外，在体外实验中抑制IRAK4（TLR信号通路中的激酶）降低了TLR-9介导的细胞因子表达，目前该策略正在进行体内测试。
适应性免疫是指抗原特异性的B细胞和T细胞反应。B细胞能够产生针对rAAV衣壳的抗体，从而使再次给药变得不可能。细胞毒性CD8+ T细胞可以识别来自GOI表达产物和rAAV衣壳的外源性肽片段，并启动对转导细胞的杀伤。CD4+ T细胞通过分泌Th1、Th2或Th17型细胞因子来辅助B细胞和细胞毒性T细胞的反应。适应性B细胞反应的形成过程与预先存在的体液免疫机制相似，因此本节将主要关注T细胞反应。
T细胞介导的不良反应：背根神经节（DRG）是沿脊髓分布的感觉神经元群，发挥传递感觉信息的关键作用。研究发现，在NHP、啮齿动物和小猪模型中，DRG损伤的发生率与剂量呈正相关。在一位人类患者中，观察到DRG毒性症状，包括感觉变化、疼痛和核磁共振成像（MRI）上DRG的增强。部分损伤可能由GOI引起，通常持续时间和影响范围有限，但严重的DRG毒性则与CD8+ T细胞的大量浸润有关，且不受类固醇的影响（https://www.fda.gov/media/152000/download）。类似地，在NHP中，系统性rAAV感染后出现的心肌炎被认为是由于心肌损伤引发的CD8+ T细胞介导的细胞毒性反应所致，表现为严重心肌炎中CD8+ T细胞的高浸润，以及酶联免疫吸附点试验中检测到的强烈的GOI特异性反应。
当前的免疫抑制药物：目前，许多试验已采用包括类固醇、利妥昔单抗和雷帕霉素在内的三重免疫抑制方案。而当前用于抑制rAAV基因治疗临床试验中免疫反应的药物几乎都最初用于治疗其他疾病（如自身免疫疾病、器官移植和肿瘤），并非专为rAAV开发（表3）。这些疾病的生理机制与基于rAAV的基因治疗可能存在显著差异，因此有必要进一步研发专门针对rAAV的药物疗法。
表3 目前在基因疗法试验中使用或在动物模型中正在研究的免疫抑制药物。
在推进对rAAV免疫学的理解过程中，有三个关键领域值得关注：首先，关于野生型AAV的基础免疫学研究存在显著空白；其次，现有免疫学研究主要集中在原代免疫细胞、源自免疫细胞的细胞系或肿瘤细胞，而忽略了rAAV基因治疗在体内靶向的多种体细胞（如中枢神经系统细胞、视网膜细胞、肝细胞和肌肉细胞），这些细胞具有各自独特的免疫特征；第三，从动物模型获得的见解并不总能反映人类临床试验中的免疫反应。为应对这些挑战，可以考虑改进体外建模系统，如混合细胞培养、3D类器官和诱导多能干细胞。此外，CRISPR筛选技术的进步可能有助于识别参与rAAV基因递送的细胞因子。创新的体内系统也在研发中，如植入人类骨髓、肝脏和胸腺（BLT）系统的小鼠模型，有望用于监测人类天然免疫受体的激活及人类适应性免疫的形成。