在开展的正式动物实验之前,为了确保动物实验能够获得有价值的药效或剂量数据,通常需要进行AAV动物预实验,探索一些实验指标,比如病毒注射方式、注射部位、注射剂量、 注射时间、稀释缓冲液等,特别是AAV注射剂量,为下一步优化的实验方案提供必要的实验依据。
 
01       动物实验
 
所有动物实验要由所在的研究所的动物伦理委员会批准,并按机构指南进行。

 

PART.01
分组

 

实验动物分组要根据实验目的来设计,一般会有对组照、实验组等划分。例如过表达某一个目的基因的AAV动物实验中,会至少设计两组:对照组(注射PBS,或者只含有表达盒但不带目的基因的AAV),以及实验组(含目的基因或序列表达盒)。如果希望能以荧光跟踪观察到AAV感染组织或范围,还可以加入表达荧光蛋白的荧光对照组。(相同血清型、启动子)

 

PART.02
动物数量

 

在设计正式动物实验时,为了使实验数据具有较好的统计意义,通常设定每组动物的个数至少是5个,考虑到动物可能发生意外死亡,6个以上为佳。当然,小鼠数目越多,结果可信度会越高,这在实验结果超出预期范围时尤为重要。

 
02     AAV注射方法选择
 
目前AAV血清型有数十种,每种类型的AAV血清型对不同的组织器官具有不同的亲和力。除此之外,AAV注射方法对组织器官的转染效果也有很大影响,AAV注射方法可以为系统性注射原位注射两种。采用相同的注射方法注射不同的AAV血清型,其组织分布也不相同。这里列举一些常见器官的推荐注射方法(不同研究文章根据实验目的不同所采取的注射方法也不同,仅供参考)。
03      AAV用量、检测时间
 
由于使用的AAV血清型、注射方式、靶器官、目的基因的表达强度、需要观察的现象不同,AAV使用量也不一致。因此,如果希望能在一轮实验中得到理想的实验结果,就需要在实验设计中设置不同的AAV用量组。

 

 

举例

单链AAV9-CAG.EGFP.WPREs.SV40pA通过尾静脉注射靶向小鼠肝脏,每只小鼠注射剂量:2E+11GC。如果EGFP替换为另一个编码长度较长的大基因,可能该基因表达强度与EGFP相似,也可能比EGFP弱,因此剂量可能需要适当提高,一般作3倍剂量变化,如增加6E+11GC剂量组。这里列举一些常见器官推荐的病毒用量及检测时间(仅供参考)。

为了获得最好的实验结果,可以在确定注射部位、注射方法后,通过设计一系列浓度梯度确定最适注射剂量。一般也可以根据查找文献来确定实验所用的AAV血清型、注射方法、病毒量、检测时间等实验参数,根据获得的文献依据,做一些预实验来确定。如果要探索血清型的靶向部位、目的基因表达效果,也可以采用一些实验方法来研究。例如,为了探索AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9血清型的转基因表达和生物分布,通过巨细胞病毒荧光素酶转基因与AAV重组表达,进行动物成像、小鼠荧光素酶表达的定量分析、荧光素酶蛋白活性等方法,确定了这些血清型在小鼠体内的靶向部位。

 

总之,预实验就是迷你版的正式实验,希望研友们在进行预实验的时候一定要尽可能地查阅相关资料与文献,准备周全后这样才能更快地推进正式实验。