AAV作为一种常用的基因转染工具，已被广泛应用于生命科学领域的基础研究和临床应用中。在使用AAV进行研究时，选择恰当的AAV血清型、启动子以及注射方式是实验顺利开展的必备条件。
为了更好的利用AAV开展研究，上一期课程我们向大家介绍了AAV血清型与启动子选择，以及几种常用的AAV注射方式与用量指南。
本期我们将继续向大家介绍另外几种AAV动物实验的注射方式。
腹部注射（系统性注射）
从笼中提取小鼠，将其放在手背，并适当安抚，稳定小鼠后再操作。
左手握小鼠，用拇指、食指捏住小鼠颈背部，无名指及小指固定小鼠尾巴和后肢，使其腹部向上，头呈低位。
右手持注射器，针头与腹部呈30度角插入小鼠下腹部离腹白线约0.5厘米处，针头刺入速度要快，刚刺入时由于鼠皮的韧性会有明显抵抗力，后面出现抵抗力突然消失的感觉，说明针头已刺入腹腔内，此时回抽没有回血，说明针头没有刺入脏器，这时可以进行药物注射了。
注意：针头刺入动作要快、轻柔，且刺入腹腔不超过 1 厘米，防止刺伤器官
待病毒注射完后，缓慢抽出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。
所有注射动作完毕后，用棉球擦拭注射部位，并将小鼠放回笼中继续观察。
视网膜下注射
通过腹腔注射唑拉西泮（2.25mg/kg体重）和盐酸甲苯噻嗪（0.7mg/kg体重）或替代品的混合物来麻醉成年小鼠（即6-8周龄）；用0.5％的去氧肾上腺素和0.5％的托吡卡胺滴眼液扩张瞳孔；
准备已经加有1.5-2μl病毒微量注射器；为了方便注射，打开眼睑，使眼睛露出赤道(equator), 并在手术显微镜下观察。保持眼睛露出赤道(equator)直到注射结束，防止在注射期间可能发生针的移位。将手指放在眼眶边缘外以便牢牢握住眼球；
在角膜表面涂抹一滴眼用粘弹性溶液；在角膜顶部放置一个小圆形盖玻片，便于显示视网膜；
使用30G1/2无菌针头在角膜缘后面的一个小孔处穿孔进行进一步的视网膜下注射；
将微量注射器的33 G钝针穿过预穿孔并进入视网膜下腔，直到感觉到轻度阻力的点为止；
将病毒载体（比如1×10⁶TU/μl）轻轻注入视网膜下腔而不发生震颤，以避免不必要的组织损伤，然后轻轻取出针头；
在手术显微镜下注射后观察视网膜下水泡的形成，以确保视网膜没有出血；轻轻关闭眼睑以覆盖注射部位，将小鼠放回笼中。
参考文献：Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium
气管内注射
从笼中提取小鼠，将其放在手背，并适当安抚，稳定小鼠后再操作；
将小鼠仰卧固定于手术台上，用止血钳固定小鼠下唇，颈部脱毛，消毒，利卡因局部麻醉；
沿颈正中切开皮肤0.5～0.8厘米，眼科镊（1 直镊、1 弯镊）钝性拨开肌肉，暴露气管，不要撕拉、挑拨气管；
手持注射器往气管内注入AAV病毒，注射速度适中，切勿过慢过快；
注射完毕拨出针头，立即解除固定，观察小鼠反应，确认小鼠呼吸畅通后对合切口，并用止血钳夹切口30s左右，并用碘伏消毒。
脑立体注射
1.实验前准备
准备脑立体定位仪、常规手术器械、颅骨钻、微量注射器、1ML注射器、干棉球、1%戊巴比妥钠、生理盐水、小鼠；
首先，用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，注射量为80 mg/100g小鼠；
待5～10min后麻醉剂起效，小鼠被麻醉后用剃毛器将小鼠头部毛发剔除干净。
2.固定小鼠
将头部剔除干净的小鼠固定在立体定位仪上。固定时，先将小鼠门齿卡在适配器门齿夹上，并轻压门齿夹横杆，随后调整适配器高度和前后位置，使耳杆可以方便进入小鼠外耳道；
左手托起小鼠头部，将左侧耳杆插入小鼠耳道，并调节左右侧耳杆使动物头部保持在U型开口的中心位置，先锁紧固定一侧耳杆，然后再旋紧另一侧耳杆，确保小鼠头部不能晃动，同时旋紧门齿夹螺丝；
检查小鼠是否固定成功：鼻对正中，头部不动，提尾不掉，目测大脑放置水平；
将手术部位的毛发用脱毛膏或剃刀去除；
然后用手术刀划开小鼠头部皮肤，去除颅骨表面结蹄组织，暴露前后囟；
根据脑图谱，确定待注射脑区的位置参数，包含离Bregma和Lambda点的距离以及核团深度；
以Bregma为0点，按照预先确定好的坐标移动颅骨钻，打开合适大小的骨窗（窗口尽量小但是又不妨碍实验）。小心地用颅骨钻在注射位点处轻磨颅骨，将颅骨慢慢磨薄，当颅骨出现裂缝的时候，用医用注射器的针头小心挑破，防止损伤。如果在此过程中有出血，可以用很小的医药棉球拉成长条形将血吸走，钻孔时一定要控制好，否则很容易在钻通颅骨后一 不小心钻头进入脑组织，造成损伤。
3.注射病毒
用PBS冲洗微量注射器（5 μL 规格）3～5次；
先吸取1μL空气，再吸取1μL稀释好的病毒（方便病毒充分注射进脑），在空气中测试注射器是否畅通；
将微量注射泵、微量注射器组装好，置于钻好的孔上方，针尖与颅骨平行（Z=0），微调注射器位置使之与之前钻孔时位置相同，根据定好的深度将注射针缓慢下降；
心脏原位注射
大鼠称重后，皮下注射阿托品1mg/kg，抑制呼吸道分泌物，肌注青霉素1万U，预防感染；
30min后，氯胺酮/安定以100:5mg比例混匀，按氯胺酮130mg/kg予以腹腔注射；
待大鼠完全麻醉后，取仰卧位固定四肢和头部，将大鼠与手术台一起倾斜45度角（大鼠头朝上）；
用组合钳小心地将大鼠舌头向下拉出口腔，暴露声门，在手电筒或头灯照射直视下于大鼠吸气相将气管套管插入气道；
接小型动物呼吸机，潮气量3～5ML，频率70～80次/分。手术区域除毛，以活力碘水剂消毒，铺无菌孔巾；
取胸骨角至剑突和胸骨体连接处连线切口切开皮肤，钝性分离浅筋膜，用止血钳剥离大鼠左侧的胸大肌，暴露左第2、3、4肋，分别在左第2、3、4肋间隙距离胸骨左缘约0.5cm处进针穿线，每个肋间隙同一进针点穿两根长约40cm的0号手术线，再将两根线用力拉向两侧，分开肋间肌和软组织并结扎肋间动脉，留取结扎线的剩余部分；
剪断大鼠2、3肋后，将两根结扎线剩余部分用力拉向两侧拉开胸腔，并固定之。充分暴露心脏及其表面的血管，剪开心包膜，用勺状套圈（自制工具）快速套住心底，轻轻提起翻出心脏，以1ml注射器在左室前壁注入rAAV 病毒；
注射后加大通气量，潮气量升至10～12ml，频率90～100次/分，充分胀肺，然后逐层关胸。整个手术过程无菌操作。待大鼠恢复自主呼吸后，拔管，装笼饲养，术后4小时给予鼠饲料及饮用水；
术后3天每日青霉素1万U肌肉注射，预防感染。
补充：
尾静脉注射感染心脏：可能由于心脏血流太快的原因，使尾静脉注射的病毒不容易富集在心脏，因此相比其他器官，需要更大的病毒量。
颈静脉注射、心腔内注射、心肌内定（多）点注射、心内包注射：心腔内注射需要结合主动脉嵌夹进行，由于开腔手术需要辅助呼吸，对手术操作要求高。病毒用量为10次方左右，稀释成20μL左右。心肌内定点注射时，使用27～29G的针头，每点注射2～5μL，注意缓慢注射，效果是在注射的局部点附近表达较高，扩散有限。
肝原位注射
肝脏一般使用尾静脉注射，尾静脉直接入肝；或者肝门静脉注射，用量与尾静脉类似；
腹部切开后，寻找到肝门静脉，将肝叶提起，下面就是门静脉，因为下腔静脉在后方，离肾脏比较近，所以一般看到大的静脉就是门静脉；
用注射器注射病毒，穿刺后压迫止血。