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AAV包装



腺相关病毒(AAV)作为基因治疗的明星载体,与慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体等其他常用病毒载体相比,具有高安全性、低免疫原性、宿主细胞范围广(感染分裂和非分裂细胞)、易生产、高穿透性、长时表达、定点整合等优点,已被广泛用于基因功能研究。

经过重组和改造的AAV载体拥有不同的血清型,根据血清型不同而具有不同的宿主范围和病毒特征,可以有效作用于特定细胞类型,包括分裂和非分裂细胞类型,在基础科学研究或临床水平的动物和细胞实验中显示出广阔的前景。

派真生物可提供多种血清型AAV定制包装,以满足您各种实验需求。我们通过创新的AAV包装工艺,确保为您提供高纯度(95%以上)、高滴度(1E+13GC/ml以上)的AAV,内毒素符合最高标准要求(<10EU/mL)。

服务内容



服务类别 纯度和总量 适用小鼠数(靶向肝脏) 周期(工作日)
常规产量AAV
(AAV1,AAV5等)
高纯1E+12GC 5 6~9
高纯2E+12GC 10 6~9
高纯5E+12GC 25 6~9
高纯1E+13GC 100 6~9
高纯2E+l3GC 200 6~9
高纯5E+13GC 500 6~9
高纯1E+14GC 1000 9~12
超低产量AAV
(AAV2,AAV4,AAV6等)
高纯1E+l2GC 5 6~9
高纯2E+12GC 10 6~9
高纯5E+12GC 25 6~9
高纯1E+13GC 100 6~9
高纯2E+l3GC 200 6~9
高纯5E+13GC 500 12~18
高纯1E+14GC 1000 12~18
未知产量AAV 5个皿 / 6-9
10个皿 / 6-9
1个CF5 / 6-9
1个CF10 / 6-9

备注:

  • 常规产量AAV:AAV1等AAV且ITR序列为野生型;
  • 超低产量AAV:AAV2、AAV4、AAV6等AAV或双链ITR载体;
  • 未知产量AAV(符合以下其中一种条件即可):
  • ① 特殊血清型:超低产血清型质粒或者新血清型质粒生产;
  • ② 客户提供血清型质粒/helper质粒;
  • ③ GOI质粒超载(ssAAV的ITR之间长度>4.5kb,scAAV的ITR之间长度>2.5kb);
  • ④ 客户提供的GOI质粒的ITR元件非野生型或者客户不提供SMAI/XMAI酶切信息以及质粒酶切后SMAI/XMAI与预测图不符合的;
  • ⑤ 非常规派真生产体系:比如客户提供包装方案;定制化的缓冲液配方;非派真常用的细胞系等。
  • 定制的AAV默认终滴度≥1E+13GC/ml(如果您有其它滴度需求,可与我们说明),体积=总量÷实际滴度;
  • 赠送的单链荧光对照病毒总量为预期定制AAV总量的10%,滴度为1E+13 GC/ml。

  服务优势 

快速:AAV总量5E+13GC以内可在6-9个工作日交付;

可靠:交付滴度≥1E+13GC/m,经进口标准品校正,不担心滴度虚高;

高质:AAV纯度95%以上、内毒素<10EU/mL,适用于病毒纯度较敏感的细胞与动物实验。此外可选测HPLC、电镜空壳率、支原体、rcAAV、TCID50等几十项指标;

血清型丰富:提供 18 种以上不同的血清型选择;

周到:及时响应式AAV专业技术支持服务,定制AAV病毒附赠10%的荧光对照病毒;

免邮:货物干冰低温运费均由派真生物承担;

全面:提供从载体设计、病毒包装到分析检测的一站式服务。

AAV包装流程



AAV质控



1. 常规质控

(1)多重酶切鉴定生产病毒所用质粒(常规质控)

(2)AAV滴度检测,SYBR Green QPCR标准曲线精确定量(常规质控)

原始扩增曲线&标准曲线

备注:派真所生产AAV的最终滴度经过与来自ATCC的AAV标准品ATCC VR-1816™(全球16个实验室共同测定认可的标准滴度),确保符合学术界主流标准,避免滴度虚高。

(3)AAV纯度检测,SDS-PAGE电泳与考马斯亮蓝染色确定纯度(用于部分AAV的常规质控)

派真AAV生产的常规检测结果 (第2、4、6~9泳道为AAV样 品,其余为蛋白Marker)

(4)内毒素检测(用于部分AAV的常规质控)

2. 其他质控

(1)HPLC纯度检测(用于部分AAV的可选质控,需额外2个工作日)

派真AAV2-EGFP样品的HPLC测试,第一个峰为AAV。按峰面积比例计算纯度为99%。

(2)电镜检测(用于部分AAV的可选质控,需额外2个工作日)

派真AAV样品电镜照片

AAV血清型选择及预实验设计参考



AAV有许多不同的血清型,其主要区别是衣壳蛋白不同,因此对不同的组织器官的转染效率存在差异。对于文献报道较少的靶组织,建议研究者通过预实验测试确定最理想的血清型,这也将是实验创新点之一。派真生物可为您提供多种AAV血清型,满足您的实验需求。

(1)体内实验

此外,由于研究领域不同、选择的实验动物不同,AAV注射部位如何选择,应该注射多少病毒,注射后多久检测等实验细节一般没有简单广泛的规则。建议研究者参考权威期刊发表的文献,或者自行试验摸索。

预实验设计参考:

血清型选择:如果您还不清楚哪种血清型最适合您的实验材料,可以尝试3种以上的荧光AAV血清型来做预感染实验。

梯度稀释感染:由于不同基因的长度和表达水平差异,我们强烈建议您在正式实验前,进行3-4次AAV梯度剂量注射来检测目的基因表达水平。

实验对照:设置一个具有相同血清型和启动子的GFP阳性对照组

检测时间:通常情况下,AAV注射3-4周后可以检测到表达产物,我们也推荐在4周或更长时间后进行检测。

(2)体外实验

细胞选择:对于体外培养的细胞,AAV-DJ和AAV6是最普遍的选择。在常规细胞培养中,AAV-DJ可以感染80%以上的细胞,而AAV6对血液来源细胞具有最强的感染效力;

梯度浓度感染:我们强烈建议您在正式实验前进行梯度浓度感染预实验(至少3-4个梯度,例如MOI=1×10^3,MOI=1×10^4,MOI=1×10^5);此外,无细胞毒性是这类实验的基本需求;

检测时间:通常在感染后2-7天进行检测。