联系我们
左侧联系我们
首页 > CRO服务 > 质粒服务 > 质粒构建与克隆

质粒构建与克隆



派真生物的质粒构建与克隆服务,可为您根据已有质粒进行改造方案的设计,完成现有质粒不同功能元件的改造,也可以根据您的需要将片段克隆至各质粒。

对于常规的shRNA、CRISPR-sgRNA、miRNA、miRNATUD质粒克隆,您只需选取合适的入口载体并提交相应需定制的shRNA、sgRNA、miRNA、miRNATUD序列即可。如果是过表达质粒构建,只需提交基因序列或者Genbank编号,派真生物会进行基因合成再完成质粒构建; 如果您提供含有目的序列的质粒作为PCR模板,派真生物收到模板和序列后会直接进行载体构建。

如果需要加标签或特定序列,请提供最终设计图谱电子版本(.gb或.dna格式)或与派真生物沟通,派真生物在此基础上再设计克隆方案。 根据不同的克隆目的,您需提供的信息和材料等细节如下表:

细胞系ND 克隆服务描述 客户提供 提供给客户
KL001 常规克隆shRNA、sgRNA、miRNA、miRNATUD 靶基因序列信息

  • 如有模板质粒, 提供4g,及相关图谱序列信息
  • 若无模板,可选择基因合成或定制质粒模板
EA/EB/EC/ED/XM//XL系列:

· 质粒图谱 · 测序结果文件
· 载体构建报告单 · 小提质粒20 ul

A/B/C/D/E/F/G/H/XL系列:

· 质粒图谱 · 测序结果文件
· 载体构建报告单
 KL002 插入序列2000bp以下的基因序列
KL003 插入序列2000bp-3000bp的基因序列
KL004 插入序列3000bp-4000bp的基因序列
KL005 插入序列4000bp-5000bp的基因序列

 

服务流程:

CRISPR/Cas9质粒

CRISPR/Cas9合成简单、周期短、操作简单、效率高,是目前研究最多、应用最广泛的基因编辑工具。目前,通过全球基因编辑领域科学家的努力,在野生型CRISPR/Cas9基础上产生了许多突变体,这些突变体能成为更高效、更便捷的基因编辑工具和系统。

派真质粒库全部为自主设计改进的增强型质粒,为保护派真的知识产权,CRISPR系列不作为质粒形态出货,只在派真公司内作包装病毒用,同意这一条款是在派真订购克隆服务的前提条件。派真生物可为您提供多种CRISPR质粒定制及后续的AAV包装服务:

SpCas9/SpCas9HF(XA/XB)


SpCas9是第—个被鉴定的CRISPR核酸酶,其PAM为NGG,PAM序列在基因中出现的频率,大约每8bp出现—次,基因长达4.2Kb。 派真生物以小于300 bp的EFS(EF1a短版本)启动子或miniCMV启动子(180 bp)驱动SpCas9, 使序列总长度不超过AAV的长度限制5Kb。

  特点 

  • 使用经过优化的sgRNA scaffold,能提高切割效率约40%;
  • SpCas9HF:SpCas9高保真度版本。K848A,K1003A, R1060A突变的SpCas9,据报道脱靶现象接近零,而切割活性与野生型相比无显著降低;

 

SpCas9定制sgRNA长度:19-20 nt
载体编号 启动子 基因 (Sp)sgRNA 搭配工作的载体或小鼠
广谱启动子驱动SpCas9+ sgRNA表达盒
XA01 EFS(广谱) SpCas9 H1启动子 自身/XA03B~ XA27
XA19 miniCMV SpCas9 H1启动子 自身/XA03B~ XA27
广谱启动子驱动SaCas9无sgRNA表达盒
XA02 EFS SpCas9 / XA03B~ XA27
XA20 miniCMV SpCas9 / XA03B~ XA27
U6-sgRNA表达盒无SaCas9
XA03B EFS mCherry U6启动子 XA01/ XA02/ XB01/ XB02/SpCas9 Tg小鼠
XA04 EFS Cre U6启动子 XA01/ XA02/ XB01/ XB02/SpCas9 X目的基因floxed小鼠
XA05 EFS mCherry-2A-Cre U6启动子 XA01/ XA02/ XB01/ XB02/SpCas9 X目的基因floxed小鼠
XA06 EFS Renilaluciferase-2A-Cre U6启动子 XA01/ XA02/ XB01/ XB02/SpCas9 X目的基因floxed小鼠
XA07 EFS ZsGreen U6启动子 XA01/ XA02/ XB01/ XB02/SpCas9 Tg小鼠
XA08 / / U6启动子 XA01/ XA02/ XB01/ XB02/SpCas9 Tg小鼠
XA09 CAG EGFP-KASH U6启动子 XA01/ XA02/ XB01/ XB02/SpCas9 Tg小鼠
XA13 EF1 mCherry U6启动子 XA01/ XA02/ XB01/ XB02/SpCas9 Tg小鼠
XA14 EF1 Cre U6启动子 XA01/ XA02/ XB01/ XB02/SpCas9 X目的基因floxed小鼠
XA15 EF1 mCherry-2A-Cre U6启动子 XA01/ XA02/ XB01/ XB02/SpCas9 X目的基因floxed小鼠
XA16 EF1 Renilaluc-2A-Cre U6启动子 XA01/ XA02/ XB01/ XB02/SpCas9 X目的基因floxed小鼠
XA17 EF1 ZsGreen U6启动子 XA01/ XA02/ XB01/ XB02/SpCas9 Tg小鼠
XA27 CAG EGFP U6启动子 XA01/ XA02/ XB01/ XB02/SpCas9 Tg小鼠

 (滚动鼠标查看更多)


SpCas9HF定制sgRNA长度:19-20 nt

载体编号 启动子 基因 (Sp)sgRNA 搭配工作的载体或小鼠
广谱启动子驱动SpCas9+ sgRNA表达盒
XB01 EFS SpCas9HF H1启动子 自身/XA03/XA04/XA05/XA06
XB03 EFS eSpCas91.1 H1启动子
XB05 miniCMV SpCas9HF H1启动子
XB07 miniCMV eSpCas91.1 H1启动子
广谱启动子驱动SaCas9无sgRNA表达盒
XB02 EFS SpCas9HF / XA03/XA04/XA05/XA06
XB04 EFS eSpCas91.1 /
XB06 miniCMV SpCas9HF /
XB08 miniCMV eSpCas91.1 /
XB09 EFS Xcas9 /
XB10 miniCMV Xcas9 /

 (滚动鼠标查看更多)

 

适用范围:

    • XA01/XB01自身有SpCas9及sgRNA,能在任何基因型小鼠上单独工作。也可以搭配XA03B~XA27提供其它sgRNA及不同启动子驱动的Cre或跟踪蛋白;
    • XA02/XB02/XA20/XB06单独提供EFS或miniCMV驱动的SpCas9表达盒:
    • XA03B~XA27还能容纳800~2200nt的供体序列作为基因组修复的模板,AAV基因组是天然的单链DNA,作为提供基因组修复模板相比双链DNA的质粒能高出约50倍同源重组效率。

 

SaCas9/ SaCas9HF(AC/AD系列)


SaCas9是活性与SpCas9相似的短版本Cas9,基因长度为3.2kb,因为有更严谨的PAM (NNGRRT),PAM序列在基因中出现的频率,大约每32bp中出现一次,靶序列的长度为21nt-23nt,理论上脱靶率比SpCas9更低。

  特点 

  • 使用了经优化的sgRNA scaffold, 显著提高切割效率;
  • SaCas9/SaCas9HF及sgRNA,能在任何基因型小鼠上单独工作。也可以搭配AC043/AC044/AC045提供更多的sgRNA及Cre或跟踪蛋白;
  • AC040/ AD040/ AC050~ AC120/ AD050~ AD120需要搭配AC041/ AC043/ AC044/AC045/ AC051~ AC121/
  • AD041 / AD051~ AD121提供 sgRNA;
  • AC043/AC044/AC045表达sgRNA及Cre或跟踪蛋白;
  • AC043/AC044/AC045还能容纳800~2200nt的供体序列作为基因组修复的模板。AAV基因组是天然的单链DNA,有数据表明,作为提供基因组修复模板相比双链DNA的质粒高出50倍修复效率。

 

SaCas9定制sgRNA长度:21-23 nt
载体编号 启动子 基因 (Sa)sgRNA 搭配工作的载体或小鼠
CMV启动子驱动SaCas9+ U6-sgRNA表达盒
AC041 CMV SaCas9 U6启动子 自身/AC043/AC044/AC045或其它
AC043/AC044/AC045或其它
AC043 CMV mCherry U6启动子 AC041/AC040/AD041/AD040/ClXX/C2XX
AC044 CMV Cre U6启动子 AC041/AC040/AD041/AD040/目的基因floxed小鼠
AC045 CMV mCherry-2A-Cre U6启动子 AC041/AC040/AD041/AD040/目的基因floxed小鼠
CMV启动子驱动SaCas9无sgRNA表达盒
AC040 CMV SaCas9 / AC043/AC044/AC045或其它
特异性启动子驱动SaCas9 + U6-sgRNA表达盒
AC051 TBG SaCas9 U6启动子 取决于实验设计
AC011 EFS SaCas9 U6启动子 取决于实验设计
AC061 Elastase I SaCas9 U6启动子 取决于实验设计
AC071 rlnsulin 2 SaCas9 U6启动子 取决于实验设计
AC081 mlnsulin2 SaCas9 U6启动子 取决于实验设计
AC091 hDesmin SaCas9 U6启动子 取决于实验设计
AC101 hSynapsin SaCas9 U6启动子 取决于实验设计
AD121 hMECP2 SaCas9 U6启动子 取决于实验设计
AC061 Elastase I SaCas9 U6启动子 取决于实验设计
特异性启动子驱动SaCas9无sgRNA表达盒
AC050 TBG SaCas9 / 取决于实验设计
AC010 EFS SaCas9 / 取决于实验设计
AC060 Elastase I SaCas9 / 取决于实验设计
AC070 rlnsulin 2 SaCas9 / 取决于实验设计
AC080 mlnsulin2 SaCas9 / 取决于实验设计
AC090 hDesmin SaCas9 / 取决于实验设计
AC100 hSyn SaCas9 / 取决于实验设计
AC120 hMECP2 SaCas9 / 取决于实验设计
AC190 CBh SaCas9 / 取决于实验设计

 (滚动鼠标查看更多)

 

SaCas9HF定制sgRNA长度:21-23 nt
载体编号 启动子 基因 (Sa)sgRNA 搭配工作的载体或小鼠
CMV启动子驱动SaCas9HF+ U6-sgRNA表达盒
AD041 CMV SaCas9HF U6启动子 自身/AC043/AC044/AC045或其它
CMV启动子驱动SaCas9HF无sgRNA表达盒
AD040 CMV SaCas9HF / AC043/AC044/AC045或其它
特异性启动子驱动SaCas9HF+ U6-sgRNA表达盒
AD051 TBG SaCas9HF U6启动子 取决于实验设计
AD011 EFS SaCas9HF U6启动子 取决于实验设计
AD061 Elastase I SaCas9HF U6启动子 取决于实验设计
AD071 rlnsulin 2 SaCas9HF U6启动子 取决于实验设计
AD081 mlnsulin2 SaCas9HF U6启动子 取决于实验设计
AD091 hDesmin SaCas9HF U6启动子 取决于实验设计
AD101 hSyn SaCas9HF U6启动子 取决于实验设计
AD121 hMECP2 SaCas9HF U6启动子 取决于实验设计
特异性启动子驱动SaCas9HF无sgRNA表达盒
AD050 TBG SaCas9HF / 取决于实验设计
AD010 EFS SaCas9HF / 取决于实验设计
AD060 Elastase I SaCas9HF / 取决于实验设计
AD070 rlnsulin 2 SaCas9HF / 取决于实验设计
AD080 mlnsulin2 SaCas9HF / 取决于实验设计
AD090 hDesmin SaCas9HF / 取决于实验设计
AD100 hSyn SaCas9HF / 取决于实验设计
AD120 hMECP2 SaCas9HF / 取决于实验设计

 (滚动鼠标查看更多)

 

AAV-CRISPR基因激活(XE系列)


在14-16 nt的短RNA指导下,野生型SpCas9能结合到靶序列DNA上但不能切割与释放。此时,经过改造加入形成MS2 RNA接头的sgRNA骨架能结合MS2-P65-HSF1 转录激活成分,从而激活下游位置的基因转录。激活基因的转录水平能达1000倍以上。

 

定制sgRNA长度:14-l5nt
载体编号 启动子 基因 (Sp)sgRNA 搭配工作的载体或小鼠
XE01E CMV MS2-P65-HSF1 U6启动子,带MS2 RNA接头 XA01/XA02/XB01/XB02/SpCas9小鼠
XE02E CMV MS2-P65-HSF1-2A-Cre U6启动子,带MS2 RNA接头 XA01/XA02/XB01/XB02/SpCas9X floxed目的基因小鼠

 

  特点 

  • XE01E/XE02E可与XA01/XA02/XB01/XB02或SpCas9小鼠搭配使用;
  • XE02E还表达Cre,也适合与SpCas9小鼠、目的基因Floxed的小鼠搭配使用。

 

其它CRISPR/Cas9质粒(XE系列)


除了SpCas9/SpCas9HF(XA、XB系列)、SaCas9/ SaCas9HF (XC、XD系列)、AAV-CRISPR基因激活(XE系列),派真生物还可以为您提供NmCas9、AsCpfl,、LbCpfl质粒。

 

定制sgRNA长度:21-23nt
载体编号 启动子 基因 (Sp)sgRNA 搭配工作的载体或小鼠
XE01F EFS NmCas9 U6启动子 自身
XE02F miniCMV NmCas9 U6启动子 自身
XE01G EFS AsCpf1 U6启动子 自身
XE02G miniCMV NAsCpf1 U6启动子 自身
XE01H EFS LbCpf1 U6启动子 自身
XE02H XE02H LbCpf1 U6启动子 自身

 

  特点 

  • NmCas9 是跟SpCas9有相似活性的短版本Cas9,基因长度为3.3kb,由于识别更长的PAM(NNNNGATT),PAM序列在基因中出现的频率,大约每128 bp中出现一次,靶序列长度为(21-23 nt),理论脱靶率比SpCas9低得多。
  • AsCpf1、LbCpf1拥有与 CRISPR-Cas9不一样的特性:更短小的sgRNA骨架;识别含T量高的5’PAM;靶标DNA被切于远离PAM的位置,且产生5个碱基突出的粘末端。

基因过表达质粒

基因过表达(gene overexpression)是将目的基因CDS克隆到相应的质粒或病毒载体上,利用载体骨架上构建的调控元件,使基因可以在人为控制的条件下实现大量转录和翻译,从而实现目的基因的过表达。

 

AAV-基因过表达(EA、EB、EC、ED系列)


双链AAV(Double-stranded AAV, dsAAV,又称self-complementary AAV,scAAV) 在体内转导效率比单链AAV(sing-strand AAV,ssAAV)高6-10倍,所有载体均有EGFP表达载体,也可在C端、N端或任意位置加EGFP/mCherry/2A/Flag/HA/His/Snap等标签。

双链AAV scAAV

载体编号 启动子 特异性
EC011 EFS 广谱
ED011
EC021 CAG 广谱
ED021
EC031 EF1a 广谱
ED031
EC041 CMV 广谱
ED041
EC051 TBG
ED051
EC061 Elastase-1 胰腺,acinar细胞
ED061
EC071 大鼠lnsulin2 胰腺,beta细胞
ED071
EC081 小鼠lnsulin2 胰腺,beta细胞
ED081
EC091 hDesmin 骨骼肌,心肌
ED091
EC0101 hSyn 神经元neuron
ED0101
ED0111 hGFAP 神经系统,星形胶质细胞astrocytes
EC0121 hMeCP2 神经元neuron
ED0121
EC0131 CaMKlla  新皮质和海马体中的兴奋性神经元
ED0131
ED0141 小鼠TRP-2 色素细胞
EC0151 mGAD1  GABA能神经元
ED0151
EC0161 rMCPT5 肥大细胞
ED0161
EC0171 hGFAP848 神经系统,星形胶质细胞astrocytes
ED0171
EC0181 cTNT 心肌细胞
ED0181
EC0191 CBh  广谱
ED0191
EC201 EF1  广谱
ED201
EC211 CaMKlla370  新皮质和海马体中的兴奋性神经元
ED211
EC241 CAGW 广谱
ED241
EC251 TH 神经系统,多巴胺能神经细胞
ED251
EC411 miniCMV 广谱
ED411

 (滚动鼠标查看更多)

单链AAV ssAAV

载体编号 启动子 特异性
EA011 EFS 广谱
EB011
EA021 CAG 广谱
EB021
EA031 EF1a 广谱
EB031
EA041 CMV 广谱
EB041
EA051 TBG
EB051
EA061 Elastase-1 胰腺,acinar细胞
EB061
EA071 大鼠lnsulin2 胰腺,beta细胞
EB071
EA081 小鼠lnsulin2 胰腺,beta细胞
EB081
EA091 hDesmin 骨骼肌,心肌
EB091
EA0101 hSyn 神经元neuron
EB0101
EA0111 hGFAP 神经系统,星形胶质细胞astrocytes
EB0111
EA0121 hMeCP2 神经元neuron
EB0121
EA0131 CaMKlla  新皮质和海马体中的兴奋性神经元
EB0131
EA0141 小鼠TRP-2 色素细胞
EB0141
EA0151 mGAD1  GABA能神经元
EB0151
EA0161 rMCPT5 肥大细胞
EB0161
EA0171 hGFAP848 神经系统,星形胶质细胞astrocytes
EB0171
EA0181 cTNT 心肌细胞
EB0181
EA0191 CBh  广谱
EB0191
EA201 EF1  广谱
EB201
EA211 CaMKlla370  新皮质和海马体中的兴奋性神经元
EB211
EA241 CAGW 广谱
EB241
EA251 TH 神经系统,多巴胺能神经细胞
EB251
EA411 miniCMV 广谱
EB411

 (滚动鼠标查看更多)

客户提供所需的物种、基因名或基因序列,由派真生物进行设计载体图谱及载体构建。

 

LV-基因过表达(XL系列)


派真生物XL系列可定制克隆您的目的基因,用于基因过表达实验。

载体编号 外源启动子 建议基因容量 启动子 筛选标签
XL01C CMV 5 Kbp
XL02C CMV 4Kbp PGK Puro
XL03C CMV 3.3Kbp EF1 CopGFP-2A-Puro
XL04C CMV 4Kbp EF1 mCherry
XL05C CMV 4Kbp IRES Neo
XL06C CMV 4Kbp EF1 copGFP
XL07C CMV 4.3 Kbp 2A-Neo
XL08C EF1 3.3Kbp CMV CopGFP-T2A-Puro
XL09C EF1 3.2Kbp CMV C-3xflag、CopGFP-T2A-Puro
XL10C CMV 4Kbp EF1 mRuby2
XL11C CMV 4Kbp EF1 mCitrine
XL12C CMV 4Kbp EF1 EYFP
XL13C CMV 4Kbp EF1 Neo,CopGFP
XL14C CMV 3.3Kbp EF1 EGFP-2A-Neo
XL15C CMV 2.7Kbp EF1 C-3xFlag、CopGFP-T2A-Puro
XL16C EF1 3.2Kbp CMV N-3xflag、CopGFP-T2A-Puro
XL17C EF1 3.9Kbp CMV C-3xFlag、CopGFP
XL18C CMV / C-3xFlag、Puro
XL19C CMV / dTomato-T2A-Puro
XL20C CMV / CopGFP
XL21C CMV / CopGFP-T2A-Puro
XL22C CMV EF1 mCherry-2A-Neo

 (滚动鼠标查看更多)

 

  特点 

  • 成熟高效表达载体,适用于多种实验设计;
  • 可用GFP、mCherry、Puro、Neo等作为筛选标记。

shRNA干扰质粒

RNA干扰(RNAi)是具有高度特异性的基因缺失研究工具。它存在于大多数真核生物中,已经广泛应用于各种真核生物的基因功能研究、药物发现和基因沉默治疗。

派真生物提供shRNA靶向基因和所需载体的文库编号。此外,我们还提供靶点设计、图谱制作和载体构建。如果目标靶点尚未经过验证,我们建议多选择2-3个候选靶点。

 

服务优势:

派真生物设计干扰位点实行3保1的政策。在目的细胞转染效率达到百分之九十(70%-90%)的前提下,针对编码基因,三个干扰序列里面保证—个在mRNA水平达到70%或以上。针对非编码基因,不承诺干扰效率。在此条件下,若三个干扰序列在mRNA水平都没有效果,您可以提供原始数据,派真再为您免费设计两个序列。

 

AAV-shRNA干扰(XM系列)


近年来,多个试验表明,靶向致病基因的RNAi药物在治疗人类疾病方面具有巨大潜力。与其他方法相比,使用AAV载体表达shRNA来引起基因表达的下调可以长期调控活体动物的靶基因,这是活体动物基因研究的常用方法。H1,U6启动子常用于转录小的干扰RNA片段。研究人员认为,H1启动子的毒性较小,可使RNAi干扰实验的结果更为可靠。

载体编号 启动子 报告基因 shRNA 启动子
XM01 CAG(广谱) EGFP H1
XM13 CAG(广谱) EGFP U6
XM14 CAG(广谱) mCherry U6
XMlS CAG(广谱) EYFP U6
XM16 CMV(广谱) EGFP U6
XM17 CMV(广谱) mCherry U6
XM18 CMV(广谱) EYFP U6

 

LV-shRNA干扰(XL系列)


派真生物XL系列可定制克隆您的靶标序列shRNA,用于高效敲降培养细胞中的靶基因表达水平。可形成发夹结构的shRNA可在U6或H1启动子驱动下表达,并同时用CMV/EF1a等启动子驱动表达GFP绿色荧光蛋白作为跟踪蛋白。

载体编号 启动子 基因 标记/筛选基因
XL01B U6启动子 CMV copGFP
XL02B Hl启动子 CMV CopGFP-2A-Puro
XL03B U6启动子 EF1a EGFP-2A-Neo
XL04B U6启动子 CMV copGFP-2A-Puro
XL05B U6启动子 CMV Puro
XL06B U6启动子 PGK Puro.lRES.mCherry
XL07B H1启动子 CMV copGFP
XL08B H1启动子 CMV CopGFP-2A-Puro
XL09B H1启动子 CMV Puro
XL012B U6启动子 CMV Neo

 

  特点 

  • EGFP、mCherry荧光蛋白作为跟踪蛋白;
  • 灵活定制克隆,可表达多个shRNA。

miRNA过表达/抑制质粒

miRNA是真核生物中的一种内源性小非编码RNA,其长度约为17-25bp。miRNA功能缺失的研究集中于筛选miRNA靶位点,筛选调节基因表达的miRNA,以及筛选影响生长和增殖的miRNA。

派真生物提供定制miRNA抑制的AAV载体,可直接用于抑制miRNA的功能并调节miRNA在活体动物中的表达。这是活体动物基因研究的常用方法。

类型

载体编号 启动子 报告基因
miRNA过表达 XM07 H1 maxGFP
miRNA抑制 XM03 U6 maxGFP
XM04 U6 EGFP
XM08 H1 EGFP

  特点 

  • 直接、方便、高效的动物实验;
  • 与传统合成抑制剂相比,作用时效更长、稳定性更高;
  • 能够通过特定的AAV血清型靶向各种器官和组织;
  • AAV-miRNA显现出更高的安全性和免疫原性。