慢病毒(Lentivirus，LV)属于逆转录病毒科(Retrovirus)，是一种球形包膜病毒，直径约80-120nm。其基因组是含两个拷贝的单股正链RNA，包含在由酶促蛋白核衣壳(NC)、衣壳(CA)、逆转录酶(RT)、整合酶(IN)和蛋白酶(PR)组成的核心内，核心被基质蛋白(MA)的蛋白质层包围。包膜蛋白(ENV)嵌入病毒粒子脂质包膜中，它与靶细胞受体结合并介导病毒粒子进入。基因组两端是长末端重复序列(LTR)，它能够让慢病毒的基因组整合到宿主基因组中转录比较活跃的位点，而且它含有强启动子和增强子。那么如果我们人为地把LTR之间的序列替换成我们的目的基因序列，在病毒感染过程中，慢病毒的基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的逆转录酶逆转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白或产生RNAi干扰，可随宿主细胞分裂传递给子代细胞，还能够稳定地在细胞内表达。
由于在一些细胞相关实验中，有些细胞难以用常规方法转染，通常通过慢病毒感染的方式将靶基因随机整合到宿主的基因组中，从而增加转染效率，并且能够在细胞系中稳定表达若干代，可进行稳定细胞株的筛选。目前，慢病毒已广泛用于基因功能研究、RNA干扰、小分子RNA研究以及活体动物实验中，成为基因治疗的有力工具之一。
图1 慢病毒载体的基因组和结构(Dong W, Kantor B,. 2021)。(A) 野生型人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基因组的简化示意图 (B) 慢病毒粒子结构。
二、慢病毒包装的原理
携带外源基因的慢病毒载体与包装载体一同转染包装细胞，即可进行病毒的包装。包装好之后分泌到细胞外的培养基中，经过离心取得上清液，再浓缩后的慢病毒液可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过逆转录，整合到细胞基因组，从而实现外源基因在宿主细胞中的表达。
图2 慢病毒包装示意图(Maes et al,. 2019)。
三、慢病毒载体
目前实验室应用最广泛的慢病毒载体(Lentiviral vectors，LVs)是以人类免疫缺陷型病毒(HIV)为基础发展起来的载体，其中HIV-1/HIV-2系统已得到了广泛应用。要想包装出一个完整病毒，我们一般需要如下几个质粒：(1)一个转移质粒;(2)一个或两个包装质粒;(3)一个包膜质粒。
(1)转移质粒：包含用于复制/转录和包装的顺式作用序列。其中包含的启动子可促使任何感兴趣的基因均以细胞类型特异性或非特异性方式表达。
(2)包装质粒：提供结构和RT蛋白(Gag-Pol)。
(3)包膜质粒：编码一种糖蛋白来假型化载体颗粒，该过程包括在病毒脂质包膜中掺入异源ENV。最常用的ENV之一是水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)，其赋予载体稳定性以及广泛的细胞趋向性。
图3 反式互补生产LVs(Mátrai et al., 2010)。
四、慢病毒包装的实验步骤
(1)构建含有目的基因的慢病毒载体。
(2)大量扩增慢病毒载体：根据实验将包装慢病毒过程中需要用到的3个质粒进行高纯度无内毒素抽提。
(3)293T细胞内进行慢病毒载体的大量包装：按一定比例将转移质粒、包装质粒和包膜质粒共转染指数生长期的293T细胞。
(4)慢病毒的浓缩及纯化：PEG8000浓缩法/蔗糖密度梯度超速离心法。
(5)慢病毒滴度测定：采用GFP荧光计数、绝对定量qPCR和RT-qPCR等进行慢病毒滴度测定。
图4 293T细胞慢病毒包装过程(E Martínez-Molina et al., 2020)。
五、慢病毒包装优势
1、感染谱广：大量文献研究表明，慢病毒载体介导的目的基因可在不同的组织或细胞中包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等长期表达。
2、稳定表达：相比瞬时转染，慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，并且可以稳定持续表达。
3、适用范围广：不仅能用于体外实验，还能用于活体动物模型，尤其是动物成瘤实验。
4、免疫原性低：慢病毒载体不表达任何HIV-1蛋白，免疫原性低，在注射部位无细胞免疫反应，体液免疫反应也较低，不影响病毒载体的第2次注射。