在基因治疗中,基因载体的递送能力和基因的大小是两个重要的挑战。对于许多遗传性疾病,如肌肉萎缩症、Stargardt病等,由于病理上涉及的基因较大,现有的递送方法往往无法满足这些较大基因的递送需求。因此,如何在不受基因大小限制的情况下递送大基因,成为了基因治疗领域亟待解决的难题。

为了解决这一问题,科学家们探索了一种创新技术——StitchR技术。这一新技术通过利用核酶(ribozyme)激活的mRNA转导联接机制,将较大基因分割为两部分并分别递送,然后在细胞内将其无缝连接,重新恢复功能性蛋白的表达。这一突破性进展有望为许多遗传疾病提供全新的治疗方案。相关研究结果发表在最新一期的Science期刊上。

什么是StitchR技术

核酸酶是一类广泛存在于自然界的小型催化RNA序列,能够特异性地对核苷酸进行自我剪切。这些核酸酶在剪切过程中生成了2′,3′-磷酸和5′-羟基的特异性末端,这些末端类似于最近被鉴定的细胞RNA修复途径的底物。

研究发现,两个独立的mRNA经过核酸酶剪切后,在真核细胞中可以实现无缝的转连接,并翻译成全长蛋白。作者将这一过程命名为StitchR(意为“缝合RNA”)。通过在哺乳动物细胞中优化StitchR活性,蛋白表达水平提高了约900倍,接近通过单一载体表达基因的水平(图1)。

图1. 在哺乳动物细胞中优化核酸酶激活的RNA转连接和翻译。(A) StitchR 3.0 RNA转连接报告基因设计示意图。包含内含子[剪接供体(SD)和剪接受体(SA)序列]的GFP开放阅读框(ORF)被分割成两个不重叠的N端(Nt)和C端(Ct)载体。在Nt-GFP和Ct-GFP载体的3′端和5′端分别使用小催化核酸酶(Rz)来创建精确的RNA末端和无缝转连接。(B) 共转染Nt-GFP和Ct-GFP载体可在细胞中产生GFP荧光(白色箭头所示)。通过优化核酸酶序列(StitchR 2.0)以及引入包含分割内含子的设计(StitchR 3.0),可以进一步增强GFP的荧光信号。(C) 对从主要核酸酶家族中选取的代表核酸酶催化的StitchR活性进行了成对比较。这些核酸酶分别克隆到StitchR 3.0 Nt和Ct-荧光素酶(Luc)载体中,并在COS7细胞中检测其活性。(D) 使用活性核酸酶(Rz)或催化突变核酸酶(mRz)与从单一ORF表达的荧光素酶相比,测定StitchR 1.0至4.0荧光素酶报告基因的相对荧光素酶活性,无论是否包含内含子。(E和F) 采用特异性重组荧光素酶mRNA缝合接缝探针进行BaseScope检测,获取转染Nt-Luc和Ct-Luc的COS7细胞中的mRNA转连接位置的共聚焦图像,(E)在24小时后,或(F)在更早的时间点检测结果图。比例尺为10μm。

StitchR的优势

StitchR技术的核心创新是利用核酶切割两条分离的mRNA序列,并在细胞内将其精准连接成一个完整的mRNA,从而产生功能性蛋白。这一过程不依赖于传统的蛋白质剪接方法,而是在RNA水平完成,无论是效率还是精准度都远远优于传统方法。

StitchR技术的主要优势有:

  • 突破基因递送的大小限制:StitchR技术能够通过将大基因分割成两部分递送,成功突破了传统AAV载体对基因大小的限制。这意味着StitchR可以应用于治疗那些因基因过大无法有效递送的疾病,如肌肉萎缩症、某些类型的遗传性视力丧失等。
  • 高效表达功能蛋白:在哺乳动物细胞中,StitchR技术可以将两条mRNA无缝连接,并确保只表达全长蛋白。这一点与其他双载体方法不同,后者虽然也能够递送较大基因,但常常由于效率低下或不完全的蛋白翻译产生不完全的蛋白产物,而StitchR技术则能精准地确保功能性全长蛋白的表达。
  • 精确修复与减少副作用:与传统的基因治疗方法不同,StitchR通过RNA级别的转导联接,能够减少基因拼接错误的发生,从而降低副作用的风险。它还避免了其他蛋白质连接技术(如inteins)可能导致的未知细胞影响。
  • 灵活的应用范围:StitchR技术可以与多种不同类型的载体(如AAV、慢病毒等)结合使用,且能够与任何mRNA序列相兼容。这为其在多个疾病领域的应用打开了广阔的前景。

 

StitchR的应用案例

与Dysferlin基因突变相关的肌肉功能障碍疾病的基因治疗

Dysferlin基因编码一种237 kDa的大型膜蛋白(图2),其功能丧失性突变会导致肌肉功能障碍,主要表现为三种营养不良表型:肢带型肌营养不良症2B/R2型(LGMD2B/R2)、Miyoshi肌病(MM)和以胫骨前肌起始的远端肌病(DMAT)。研究者使用StitchR技术,通过分割Dysferlin基因并分别递送两个mRNA片段,成功在动物模型中恢复了Dysferlin蛋白的表达,并显著改善了肌肉功能。

图2. StitchR介导的在Dysferlin基因敲除小鼠(A/J品系)中表达人类全长Dysferlin(DYSF)。(A) Dysferlin基因编码一种大型膜相关蛋白,其功能丧失突变会导致肢带型肌营养不良症2B/2R型、Miyoshi肌病(MM)和以胫骨前肌起始的远端肌病(DMAT)。Dysferlin的开放阅读框(ORF)超出了单个AAV载体的包装能力,但可以通过使用双AAV载体方法完全包装。采用StitchR介导的双AAV9载体方法,在肌肉特异性CK8e启动子的控制下重构并表达全长人类Dysferlin。(B和C) 人类Dysferlin在股四头肌中广泛表达,并与野生型Dysferlin类似地定位在肌纤维膜上,但也观察到在细胞内积累,这在其他Dysferlin转基因方法中也有类似发现。(D) WesternBlot显示,使用StitchR Nt和Ct-Dysferlin AAVs注射的小鼠中表达的人类Dysferlin蛋白的模式与小鼠中野生型Dysferlin相似。(E至G) 在股四头肌中,与野生型雄性和雌性小鼠中观察到的水平相比,全长人类Dysferlin的表达水平为150.8%,在胫骨前肌(TA)中为114.1%,在心脏中为510.6%。

杜兴氏肌营养不良症(DMD)的基因治疗

DMD中的Dystrophin蛋白由一个超过两个AAV基因组包装限制的开放阅读框编码,其大片段缺失通常表现为较为温和的Becker肌营养不良症(BMD)。作者用StitchR 4.0载体对表达了截短但功能性强的人类Dystrophin(DH2-R15)(图3)。在Dystrophin-KO小鼠(D2-mdx)中,使用肌肉特异性AAV9载体和CK8e启动子注射后,StitchR注射的小鼠中股四头肌和膈肌骨骼肌中的肌肉结构得到保持,并且内肌膜纤维化正常,明显优于对照组。免疫荧光染色显示DH2-R15 Dystrophin正常膜定位,并广泛表达在肌纤维中。与其他严重截短的迷你或微Dystrophins不同,DH2-R15 Dystrophin能够恢复nNOS的膜定位,且在股四头肌、TA肌肉和心脏中的蛋白表达接近正常水平。免疫印迹和光密度测量进一步确认了DH2-R15 Dystrophin的表达,并且肌肉损伤标志物恢复至野生型水平。

图3. 在DMD小鼠模型中,使用StitchR介导的全功能DH2-R15肌营养不良蛋白的治疗结果。(A) Dystrophin基因中的功能丧失性突变导致杜氏肌营养不良症。Dystrophin基因中的大片段缺失,导致肌营养不良蛋白截断,结果是较轻的贝克肌营养不良症(BMD)。通过使用StitchR介导的双AAV策略,表达一个全功能的(DH2-R15)肌营养不良蛋白,其大小超过了在BMD中发现的一些截短型肌营养不良蛋白。(B至D) StitchR介导的DH2-R15肌营养不良蛋白通过双AAV9载体进行体内递送,在骨骼肌中表达,并且肌肉特异性CK8e启动子挽救了肌肉病理,正确定位在肌纤维膜上,并纠正了nNOS的膜定位,这在D2-mdx小鼠中通常被破坏。(E) 肌肉裂解物的Western Blot显示只有全长DH2-R15肌营养不良蛋白表达,并且在雄性和雌性小鼠的股四头肌中与野生型水平相似。(F) 密度测定显示DH2-R15肌营养不良蛋白,相对于Vinculin表达,达到了野生型肌营养不良蛋白水平的94.9%。(G) StitchR 介导的DH2-R15肌营养不良蛋白在D2-mdx小鼠中表达,使血清肌酸激酶(CK)水平正常,并且(H)显著减少了中心核肌纤维的百分比,这两者都是DMD的标志。

基因编辑

目前的基因组编辑系统,如CRISPR和先导编辑,受限于AAV载体的包装能力。作者开发了StitchR 4.0载体对以表达先导编辑PEmax(StitchR-PE)(图4,A和B)。使用先导编辑GFP报告基因系统,StitchR-PE在细胞中产生了强烈的GFP荧光,与单ORF表达PEmax的载体相当(图4C)。为了量化活性,作者开发了基于荧光素酶的报告基因LUPER,结果显示StitchR-PE的活性为单ORF表达PEmax的82%,是先前报道的载体的两倍(图4E)。为了调控PEmax的长期表达,作者通过化学调节发现,ecDHFR-StitchR-PE在缺乏甲氧苄啶时活性显著抑制,而在1 mM TMP存在下,活性增加了约35倍(图4,G和H)。

图4. StitchR介导的先导编辑。(A) 设计了一个StitchR介导的Prime Editor(StitchR-PE)来表达Prime Editor PEmax和Prime Editing组件,包括(B)在Ct载体中包含了用于质粒编辑导向RNA(pegRNA)和切口酶单导向RNA(sgRNA)盒。(C) 使用PEAR-GFP质粒编辑报告基因比较了StitchR-PE活性与从单一ORF表达的PEmax。(D) 设计了一个基于荧光素酶的质粒编辑报告基因(LUPER)以精确比较从单一ORF表达的StitchR-PE和PEmax。(E) 在LUPER报告基因测定中,StitchR-PE的活性为从单一ORF(不含内含子)表达的PEmax活性的81.2%,是基于分裂内含肽PEmax载体对活性的两倍。(F) 为了生成一个化学控制的先导编辑系统,我们将大肠杆菌(ecDHFR)的不稳定域融合到StitchR Nt载体中PEmax的N端。(G) 在没有TMP(DMSO对照)的情况下,只观察到少数PEAR-GFP阳性细胞,而(H)添加1 mM TMP导致PEAR-GFP表达细胞的显著增加和LUPER Prime Editing荧光素酶报告基因的37倍增加。

StitchR的应用前景

StitchR技术的突破为基因治疗的未来打开了广阔的应用前景。随着技术的进一步优化,StitchR有望在以下几个方面产生深远的影响:

  • 遗传性疾病的治疗:对于那些因基因过大而无法使用传统方法治疗的遗传性疾病,如肌肉萎缩症、某些类型的遗传性视力障碍等,StitchR技术提供了一个理想的解决方案。
  • 癌症免疫治疗:StitchR不仅能够递送大分子治疗基因,还可以用于免疫治疗相关基因的递送,如免疫检查点抑制因子、细胞因子等,增强癌症免疫治疗的效果。
  • 细胞治疗和组织再生:在细胞治疗和组织再生领域,StitchR可以用来递送需要高效修复的基因,帮助恢复受损组织的功能,特别是在神经、肌肉等需要大分子蛋白修复的领域。
  • 疫苗开发:StitchR可以用来递送较大且多变的免疫原性基因,为新型疫苗的研发,尤其是针对变异病毒的疫苗提供新的思路。

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