帕金森病(PD)是全球第二大神经退行性疾病,65岁以上人群中患病率约2%,其特征为中脑黑质脑区多巴胺神经细胞退变和病理性α-synuclein蛋白聚集。约10%的PD由基因突变引起,尤其是PINK1和Parkin基因。大量的体外研究表明PINK1激活Parkin,共同促进受损线粒体清除,保护神经细胞。然而,目前缺乏生理状态下PINK1激活Parkin的体内证据,且现有动物模型无法模拟PD的神经退变特征,这限制了对PINK1和Parkin功能的研究。
2024年10月15日,暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院的杨伟莉、李世华李晓江团队在国际医学研究领域权威期刊Journal of Clinical Investigation(IF=13.3)在线发表题为Deficiency of Parkin causes neurodegeneration and accumulation of pathological α-synuclein in monkey models的研究论文。研究团队通过基因编辑技术构建了Parkin基因缺失猴模型,确定了Parkin磷酸化是帕金森病发病的关键因素,为帕金森病的发病机制和潜在治疗方案提供了新视角。

研究亮点

首次构建灵长类Parkin基因敲除模型:首次在灵长类(猴子)中构建Parkin基因缺失模型,并观察到与人类帕金森病类似的黑质神经元退行性变和pS129-α-突触核蛋白积累,而以往的小鼠和猪模型中Parkin缺失并未导致显著的神经退行性病变,这一发现强调了灵长类模型在帕金森病研究中的独特性和必要性。
首次在体内证实Parkin磷酸化的关键作用:研究发现,在灵长类动物中,PINK1激活Parkin的S65磷酸化对神经保护至关重要,能减少有毒α-突触核蛋白积累。这项研究首次在体内证实了PINK1与Parkin磷酸化的关系,强调了Parkin磷酸化在神经元存活和帕金森病发病中的重要作用。
治疗潜力的验证:该研究通过用AAV过表达野生型Parkin,验证了Parkin磷酸化可以有效减少毒性pS129-α-突触核蛋白的积累,指出增强Parkin活性作为帕金森病潜在治疗方案的可行性。

主要研究结果

1、猴PARK2基因缺失导致年龄依赖性神经退行性变化

利用CRISPR/Cas9技术构建不同年龄的Parkin基因缺失猴模型,发现Parkin缺失对猴大脑早期发育中的神经细胞存活无明显影响,但随年龄增长,猴中脑黑质多巴胺神经细胞出现明显变性及死亡,纹状体部位多巴胺合成减少(图1),病理性pS129-α-syn聚集,成功模拟了PD病人脑中的重要病理特征,这与Parkin敲除的小鼠模型及猪模型无法模拟PD病人脑中神经细胞退变死亡的重要病理形成鲜明对比。
图1敲除Parkin导致成年猴中脑黑质多巴胺神经细胞的退变死亡。(A) 通过立体定位注射AAV9-parkin gRNA-RFP/Cas9到猴脑区域,敲除猴Parkin基因(PARK2)。(B) 低倍显微镜照片,通过RFP反映的病毒在注射猴黑质区的感染情况。(C) 双重免疫荧光染色显示,AAV9-parkin gRNA-RFP/Cas9感染的黑质神经元(箭头所示)Parkin表达减少。(D和E) 免疫荧光染色显示,Parkin敲除导致猴子黑质中的TH阳性神经元数量减少,且在年老(25岁)猴中的神经元减少更为严重。(E)。(F) 注射AAV-Cas9/对照gRNA和AAV-Cas9/parkin-gRNA的猴子黑质中TH阳性神经元数量统计。
2.PINK1与Parkin磷酸化的关系

已有的体外研究发现PINK1可在Ser65位点磷酸化激活Parkin,但由于PINK1蛋白在生理状态下的小动物脑内及常见细胞系中表达较低,检测不到,因此尚无生理状态下的体内证据证明PINK1介导Parkin的磷酸化。本研究发现敲除PINK1基因可明显减少磷酸化Parkin(pS65-Parkin)表达,并伴随出现由pS129-α-syn蛋白聚集而成的路易氏小体(图2)。

图2. PINK1缺失可导致猴中脑黑质中的Parkin磷酸化水平显著下调,病理性S129-α-synuclein蛋白表达明显增加。猴脑区注射AAV病毒载体表达CRISPR/Cas9敲除PINK1基因后,Western blot结果(A)和免疫组化染色(B-C)显示,磷酸化Parkin(pS65-Parkin)明显减少,而毒性的α-synuclein蛋白显著增加。(D)高倍镜下有毒性α-synuclein蛋白形成路易小体。

3.Parkin磷酸化的作用(图3)

研究发现,随着年龄增长,Parkin磷酸化水平显著降低,导致pS129-α-syn的积累。在正常衰老猴脑的黑质区域中,Parkin蛋白的不溶性增加,伴随更高水平的氧化应激产物(如yH2AX和8-OhdG)积累,这进一步加速了pS129-α-syn的堆积,提示衰老可能是引发磷酸化Parkin功能下调从而介导脑功能异常的一个重要因素。
进一步研究结果显示Parkin蛋白的S65磷酸化在PINK1依赖的神经保护中起重要作用。过表达野生型PINK1和Parkin均可通过增加Parkin磷酸化水平而减少老年猴脑中病理性α-synuclein蛋白的聚集,而无法被PINK1磷酸化激活的Parkin突变体(S65A)则无此效果。
图3磷酸化Parkin在PD病理中的重要机制模型。在正常的灵长类动物大脑中,PINK1蛋白发挥激酶功能磷酸化激活Parkin,磷酸化形式的S65-Parkin通过清除pS129-α-syn等毒性蛋白使黑质神经元维持健康状态。然而,PD病人脑内,当发生Parkin或PINK1突变以及衰老造成的氧化应激时Parkin磷酸化水平降低,进而导致pS129-α-syn 等毒性蛋白积累,并最终导致患者脑内发生年龄依赖性的神经退变。

结论

本研究首次揭示了在生理状态下的动物体内PINK1激酶可磷酸化Parkin的证据,且Parkin 磷酸化的减少与pS129-α-syn蛋白的聚集相关,而通过提高Parkin蛋白磷酸化水平可显著减少pS129-α-syn蛋白的聚集毒性,从而对神经细胞起到有效的保护作用。这为携带PINK1及Parkin突变的PD患者在临床上具有相似的表型提供了新的分子机制,同时也表明增强Parkin活性可能成为帕金森病治疗的潜在策略。
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本篇文章AAV的导入方式:

实验动物 猕猴
血清型 AAV9
启动子 CMV, U6
注射方式 脑立体定位注射至前额皮质、纹状体或黑质
注射剂量 病毒滴度1 x 10^13 vg/mL,注射体积5~10 μL
检测时间 感染后2-3个月