从无声到有声：耳蜗基因治疗的突破与前景
通过单次局部注射腺相关病毒（AAV）载体，一些携带OTOF基因突变的常染色体隐性遗传耳聋9型（DFNB9）儿童的听力得到了部分恢复，这些研究证据强有力地支持了基因疗法在治疗人类听力损伤中的安全性和有效性。目前有新证据表明耳朵与大脑之间可能存在双向液体交换，因此如何优化内窥镜和经乳突注射技术，以降低耳蜗基因治疗的副作用，是当前研究的重点之一。新型AAV衣壳和基因编辑技术已在动物模型中取得成功，有望进一步提升对耳蜗的靶向性。本文将总结耳蜗基因疗法的最新进展，探讨新方法在现有及未来临床试验中的转化潜力，并分析其在人类应用中仍需明确的关键问题。
https://mp.weixin.qq.com/s/OyfQ5hLhptebylnXnl269Q 证实了 OTOF 基因疗法的安全性和有效性。在6名因OTOF 双等位基因突变而听力严重障碍的患儿中，5名患儿的听力得到了明显改善，听力阈值恢复至 38-50 分贝，并在术后 26 周内持续保持。同时，这些孩子的语言感知能力也有显著提升。
由于 otoferlin 基因的 cDNA 长度超过了单个 AAV 递送的容量上限（编码序列为 3.5-4 kb，加上 1-1.5 kb 的启动子等调控元件），研究人员采用了将 cDNA 分段并通过两个 AAV 单独递送的方法，这一策略最初被用于 Usher 综合征 1B 型的基因治疗。目前采用AAV2/1（与毛细胞特异性启动子结合使用）和 AAV2/Anc80L65的双AAV递送策略已经完成了临床前测试，结果表明两种AAV衣壳均能在几种不同物种中有效转导内毛细胞，即听觉系统的感觉细胞。
注射方式的选择及考虑因素
在基因递送的临床前研究中，通常选择新生啮齿动物（如小鼠实验）作为实验动物模型，因为在这些模型中，耳蜗尚未完全成熟，手术创伤较小，操作难度也较低。以小鼠为例，其听觉功能通常在出生后第12至14天才开始成熟。未成年或成年动物更贴近人类新生儿或儿童的耳蜗生理状态，因为人类胎儿的听觉功能会在孕19至20周时开始发育（图1），近期的研究已成功地在未成年或成年小鼠中实现基因疗法的递送。
狨猴耳蜗的发育与人类耳蜗的发育进程基本一致，但时间上早于人类1至2周左右。而人类耳蜗发育的前三个月，与小鼠的整个妊娠期基本相对应。耳蜗的成熟以及神经支配的发育在人类妊娠的3-6个月内完成，对应小鼠的出生后时期。这一阶段耳蜗逐渐具备自发活动能力，随着形态发育的同步进行，耳道开始打开，小鼠开始有初步的感官体验。
在小鼠中，耳蜗被认为在出生后1至2个月期间分子和生理功能上完全成熟，这一阶段大致对应狨猴15个月大和人类妊娠3-6个月。生理退化的初步迹象通常出现在中年阶段，其中小鼠为10至15个月大，狨猴为4至7岁，而人类为38至50岁。随着年龄增长，听力退化的症状愈加明显（小鼠18个月以上，狨猴8岁以上，人类60岁以上）。这种退化至少部分是由于毛细胞功能障碍、神经丢失及血管纹萎缩引起的。E，胚胎日；P，出生后日；W，周；M，月；Y，年。
图2耳蜗基因治疗的不同给药方式。小鼠中采用后半规管（PSCC）注射，而人类中使用外半规管（LSCC）注射，分别以蓝点和红点表示。此外，还包括前庭囊注射和耳蜗开窗术（用于小鼠），以及经乳突或经圆窗膜（RWM）的注射，这两种方法在小鼠和人类中均有应用，图中以蓝/红渐变点表示。
耳蜗开窗术常用于人类人工耳蜗植入手术，尤其是在解剖结构复杂或难以接触RWM的情况下。然而，这种方法尚未被用作人类基因治疗的给药方式。
在小鼠模型中，蛛网膜下腔（CM）注射可以直接接触脑脊液（CSF），通过耳蜗水道运输至耳蜗的鼓阶。虽然这种注射方式属于全身性给药，但其优势在于单次注射即可实现双侧耳蜗的基因转导。
尽管通过CSF进行的听力障碍基因治疗尚未被验证，但考虑到选用病毒载体的全身安全性，这种外科干预在未来可能成为一种可行的治疗方式。
例如，通过前庭器官（方法1和2）注射可能由于人类颞骨中这些结构的深部位置而受到限制，并可能带来额外的前庭功能障碍风险。而鼓室造瘘术不可避免地会损伤内耳的关键结构，如血管纹，从而导致动物模型中不可逆的听力损失。尽管如此，这种方法在人工耳蜗植入手术中已是一种成熟的操作。在使用圆窗膜（RWM）注射时，如果未进行骨架开窗处理，可能会导致内耳液体的超压，并通过耳蜗水管（CA，aquaeductus cochleae）释放。这种液体压力可能会导致病毒载体逃逸至脑部结构，并通过脑脊液（CSF）传播。这种现象可能是基底毛细胞和顶部毛细胞转导率较低的原因。这种情况不仅在啮齿动物中存在，在非人灵长类动物（NHPs）中也有观察到。
相比之下，结合开窗技术的RWM注射（例如在半规管中开一个小孔）可以更有效地释放压力，从而实现病毒载体在耳蜗内更均匀的分布。在大量临床前研究的基础上，人类临床试验已逐步优化了递送方法。例如：（1）在外侧半规管开一个小孔，或（2）在圆窗膜注射时结合卵圆窗的开窗处理，以释放内耳液体的压力。
目前，大多数试验倾向于采用微创的经外耳道内窥镜手术，这种方法特别适用于儿童患者的耳科手术。另一些试验则沿用人工耳蜗植入手术中经典的经乳突途径。
大脑与耳蜗之间的双向液体连接
有趣的是，在上述所有注射方法中，啮齿动物模型常观察到对侧未注射耳朵的基因转导现象，这表明存在一种液体通路，使病毒载体能够从一侧耳朵转移到另一侧。至于这些AAV载体是否会在非人灵长类动物（NHP）和人类中通过耳蜗水管（CA）向脑脊液（CSF）传递，并在内耳以外的其他组织中实现转导，目前仍存在争议。例如，在小鼠中，RWM注射后可以观察到小脑的广泛转导，但在猕猴（Macaca mulatta）中使用类似给药途径时，中枢神经系统中的AAV2/Anc80L65或AAV2/1的基因组拷贝水平仅接近背景水平。
近期针对猕猴和绿猴（Chlorocebus aethiops）的一项研究表明，通过脑室内注射三种不同AAV血清型（AAV2/1、AAV2/2、AAV2/9）进行CSF递送，也可以实现耳蜗转导，这进一步证明在NHP中，大脑和耳蜗之间确实存在液体交流。
耳蜗水管（CA）被认为是连接脑脊液与外淋巴液的关键通路。最近的临床前研究结合体内时间延迟磁共振成像（9.4 T临床前扫描仪）、计算机断层扫描以及光学荧光显微镜，进一步验证了脑脊液与耳蜗外淋巴液的连接。研究发现，将对比剂gadobutrol注入充满脑脊液的大枕大池（CM）后，仅需一分钟便能到达耳蜗。
关于AAV载体的研究，两项独立的小鼠实验显示，通过单次将AAV载体注入大枕大池，不仅能够实现双侧耳蜗感觉内毛细胞的基因转导，还可以在成年小鼠中挽救因DFNA25（常染色体显性遗传性进行性非综合征性耳聋）引起的听力损失。虽然从耳蜗外淋巴液向脑脊液的液体交换尚未通过影像学直接证实，但大量研究证据已经表明耳蜗和脑脊液之间确实存在双向液体交换。
在人类中，脑脊液与耳蜗之间的液体连接已被证实。脑池造影术是一种用于评估颅底脑脊液泄漏的检查方法。在15名患者中，通过这种方法观察到钆对比剂逐渐扩散到耳蜗和前庭，进一步支持了两者之间的液体交流。在人类耳蜗中，耳蜗水管的尺寸与啮齿动物相似，其宽度约为100μM，长度约为400μM，相对于人类整体解剖结构而言显得较小。研究表明，耳蜗水管的通畅性可能随着年龄增长而逐渐下降，但也不能完全排除由于颞骨组织学伪影造成的干扰。一些研究通过分析颅内或姿势变化引起的鼓室内压力变化，间接推断耳蜗水管的功能状态。结果显示，在年轻成人中，约89%的耳蜗水管是通畅的，而在老年人中，这一比例下降至70%。此外，最近的高分辨率颞骨CT扫描研究显示，成人中有14%（3/22）的耳蜗水管无法被检测到，而在儿童中这一比例仅为1%（1/85）。这些数据表明，耳蜗水管的通畅性可能随年龄变化有所不同。尽管需要更多研究来进一步探索人类耳蜗水管的通畅性及其与脑脊液的液体交换机制，但目前的研究结果已明确显示，人类大脑的液体与耳蜗的液体之间存在连接。
脱靶和副作用
目前针对耳蜗基因递送的潜在组织脱靶效应和负面影响的研究较少。Mathiesen等人通过大枕大池（CM）注射AAV9-PHP.B载体到小鼠体内，并评估了病毒表达、免疫反应变化以及对行为的影响。研究显示，在CM注射的情况下，未发现肝脏、皮层或海马CA3区的转导。然而，在海马CA2区中约有不到5%的成熟神经元（NeuN+标记）显示出组织非靶向性转导，而小脑中的这一比例约为20%。尽管未观察到耳蜗或大脑的炎症反应，也未对小鼠的行为产生影响，但这些发现表明，通过CSF递送基因可能存在不可忽视的风险，可能会影响耳蜗以外的其他组织和细胞。
几项临床试验正在评估AAVs颅内递送治疗神经退行性疾病的效果（ClinicalTrials.gov注册号：NCT03580083、NCT03566043、NCT04127578、NCT04408625、NCT04411654 和 NCT04713475）。到目前为止，这些试验在人类中尚未报告重大并发症。然而，最近完成的一项试验（NCT02362438）通过鞘内基因疗法治疗巨轴突神经病，报告了一些不良反应，其中包括一例可能与治疗本身相关的严重不良事件。尽管尚未对这些试验中的耳蜗组织进行死后分析，但这类分析可能揭示鞘内给药对双侧耳蜗靶向的潜在影响。现有的证据强调，无论采用局部注射还是鞘内给药，都必须通过充分的临床前研究来评估基因疗法载体的安全性。尤其是在考虑CSF递送途径时。
通过载体和AAV衣壳工程减轻脱靶效应
由于AAV载体在特定细胞群体中的靶向性不够特异，因此需要进一步优化靶向策略，以最大限度地减少组织非靶向性和潜在副作用。近年来单细胞水平的转录组学和表观遗传学分析技术的进步，为识别能够将病毒表达限制在特定组织和细胞类型的调控元件提供了可能。同样，对耳蜗中细胞类型特异性细胞表面受体的了解也为开发新的特异性靶向方法提供了机会。例如，通过在AAV衣壳上展示双特异性DARPins（设计型ankyrin重复蛋白），可以进一步增强靶向性。因此，结合AAV衣壳改造和特异性靶向耳蜗目标细胞的启动子，最终有望使治疗收益大于潜在风险。
另一种减轻副作用的方法是利用AAV载体递送基于CRISPR的基因编辑工具，针对特定的与听力相关的基因进行修复。理论上，基于CRISPR的基因编辑方法仅会影响表达目标基因的特定细胞类型，从而进一步提高细胞特异性。研究表明，CRISPR-Cas基因编辑对治疗由突变基因引起的常染色体显性遗传性疾病（包括遗传性耳聋）表现出较高的有效性。此外，CRISPR技术已经扩展到多个应用领域，包括DNA和RNA编辑，以及耳蜗基因的表达调控。
然而，CRISPR-Cas技术也可能作用于非特异性基因组区域，导致脱靶。针对这一问题，已经开发出多种Cas9变体，以提高基因编辑效率，降低脱靶风险。考虑到CRISPR基因疗法在解决人类疾病中的潜力， 基于AAV载体和Cas9变体的基因疗法预计将在不久的将来实现高效的治疗效果，同时最大程度地降低脱靶风险。
非人灵长类（NHP）模型的转化验证和潜力
尽管基因疗法恢复听力的效果已在小鼠疾病模型中得到了验证，这些模型也能以较高的保真度模拟人类听力表型，但AAV载体的细胞特异性及安全性仍需在大型动物中进行验证，尤其是在非人灵长类模型中。猕猴是目前的首选模型，研究者已建立了一套标准化操作方法，利用听性脑干反应（ABR）和（畸变产物）耳声发射来评估听力功能。AAV2/9-PHP.B载体已被应用于多种动物研究中，是少数用于猕猴内耳研究的载体之一，其他载体还包括AAV2/S、AAV2/1和AAV2/Anc80L65等。然而，目前大动物的行为数据较少，因此可能需要引入其它NHP模型，如狨猴（Callithrix jacchus），以进一步确保从啮齿动物模型的研究结果能够转化为临床应用。
狨猴体型较小，是听觉研究中广泛应用的NHP模型，其耳蜗解剖特征与人类相似。狨猴是极具发声能力的物种，表现出复杂的发声行为，其中一些特征与人类语言有相似之处。与猕猴相比，狨猴的叫声库更大，发声更为频繁，因此能够在神经生理及行为层面评估基因疗法对听力的影响。例如，狨猴从婴儿期到成年期的发声发育需要父母的反馈。如果缺乏与父母的充分互动，狨猴的发声行为可能会保持不成熟状态。通过狨猴模型可以研究听力改善是否足以让其完全恢复物种特有的发声行为。此外，狨猴还表现出轮流发声的行为模式，以可预测的方式相互交流，并通过发声个别标记同种个体。成年狨猴的发声行为依赖于听觉反馈，并且能够根据听觉干扰进行调整。狨猴也可以被训练灵活地检测和辨别声音。这些听力与发声特性使得狨猴能够在受控实验中为量化听觉表现提供可靠的数据支持。总之，狨猴在神经生理和行为研究领域具有重要的实验价值，为评估听力基因疗法提供了有力的支持。
结论
递送仍是基因疗法体内应用的主要障碍，解决这一问题至关重要。如果能够实现组织靶向和外源基因特异性表达，那么对于患者而言，应优先选择侵入性最小的注射方式（无论是局部注射还是全身注射）。由于脑脊液途径对耳朵基本无创，且可能通过一次手术完成双耳转导，因此这种途径或将成为未来治疗双侧耳聋的主流。
2023年通过的FDA现代化法案2.0将进一步推动内耳基因疗法的发展。该法案支持使用非动物方法作为药物安全性和有效性测试的替代方案，这为内耳基因疗法的临床应用铺平了道路，至少在美国范围内可以加速发展。然而，尽管许多基于人类的体外替代方法（如类器官）已在众多器官研究中取得卓越成果，听力领域仍处于起步阶段，亟需更多关注。在这些基于非动物方法的转化效果尚未完全建立之前，基因疗法的安全性和有效性测试仍需依赖动物模型。
即便所有上述问题都能顺利且积极地解决，是否意味着人工耳蜗（CI）时代将因此终结？可能并非如此。许多与听力损失相关的基因在耳蜗发育过程中起着至关重要的作用，而通过病毒载体在出生后进行基因功能拷贝的补充，可能无法在人类中恢复正常听力。此外，尽管在发达国家，先天性听力损失中单基因因素占比超过一半，但成人听力损失主要由环境因素（如噪音暴露或耳毒性药物）引起，同时伴随着极罕见的单基因变异的晚发性发病以及多基因遗传因素的复杂作用。因此，对于这些患者，单一的基因疗法可能并非可行的解决方案。相反，我们预见未来基因疗法与人工耳蜗技术相结合，将共同优化耳鼻喉科领域的个性化治疗方案，为更多患者提供更加全面和精准的治疗选择。
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