派真生物丨AAV纯度的“隐藏杀手”——杂质铁蛋白浅谈

腺相关病毒（AAV）具有免疫原性低，宿主范围广泛，体内表达基因时间长等优点，因此成为基因治疗递送载体首选。

在AAV进入临床运用前，需要对载体进行非常严格的质量控制，如AAV空壳/实心比率，杂质含量等，从而使AAV载体在临床运用时将可能发生的意外风险降至最低。在多种质量控制方法中，透射电子显微镜（TEM）是最直接的观测方法，使用专属染色后可以直观地反映AAV实心与空壳的比率。

派真生物在AAV生产工艺和质量检测上一直有着业界最严格的标准和要求。我们的质检平台在TEM检测及常规纯化时,  发现了一种不易被发现，常常被其他AAV包装服务商忽略的杂质现象，如图1。

在AAV电镜检测的结果中，我们发现某些AAV载体附近存在细小的颗粒物，如图1所示。

它们是什么？它们来自何处？

这个现象引起了我们检测人员的关注。要知道，历史上AAV之所以被发现，就是因为它最初总是出现在腺病毒（Adenovirus）的电镜检测结果中。另外，从质量研究的角度来看，我们不放过一切影响AAV纯度的杂质。

经过对银染的SDS-PAGE凝胶的观察，我们也发现了蛋白杂质条带，如图2。通过分析我们认为，这些杂质条带很可能就是TEM检测结果中发现的那些细小的颗粒物。

图2. AAV样品SDS-PAGE染色结果。M:蛋白分子量标记；S1：AAV样品1；S2：AAV样品2；VP1-3：AAV衣壳蛋白。

派真生物每年都交付给世界各地的研究者们数千批次的AAV样品，在交付之前派真都会做严格的AAV放行检测。在这一检测项目大数据中，我们发现这些蛋白杂带主要集中于10-20KDa附近。经过我们的质谱分析科学家解析，结果表明这些杂带来自人源铁蛋白，是宿主细胞来源的细胞裂解物。

图3. 颗粒物质谱检索结果

因为这类蛋白通常不会被通用型的HCP ELISA抗原覆盖，从而可能导致漏检，低于宿主蛋白的残留量。另一方面，我们对电泳中的铁蛋白污染富集后，再进行电镜分析，也印证了铁蛋白就是使用通用纯化工艺中存在的小颗粒。

图4. 铁蛋白电镜负染结果

文献针对铁蛋白的污染在业内也鲜有报道。2018年，Sean M. Crosson的文章中提及，铁蛋白的污染会影响AAV的效价，值得各位早期研究者重视。因此，在QC团队对于AAV进行杂质研究的同时，我们工艺开发团队也针对性对铁蛋白污染进行了工艺攻关。经过多种创新性的工艺尝试后，我们做到了把铁蛋白的残留下降了几个数量级，在电镜图谱上细小颗粒物已经消失不见，如图5。这个新的纯化工艺一直应用在我们的常规AAV生产中，为派真AAV的质量保驾护航。

 

图5. 派真优化工艺后AAV电镜负染结果

参考文献

Sean M. Crosson, Peter Dib, J. Kennon Smith, Sergei Zolotukhin,Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation,Molecular Therapy – Methods & Clinical Development,Volume 10,2018,Pages 1-7