解决临床应用障碍，刘如谦将碱基编辑器装入单个AAV中，并成功进行体内高效编辑

7月 29, 2022

碱基编辑器（base editor，BE），是 Broad 研究所刘如谦（David Liu）自2016年以来陆续开发和改进的一类基于CRISPR的精准基因编辑平台。与CRISPR-Cas9不同的是，碱基编辑可以在不切割DNA的情况下实现对单个碱基的精准编辑，因此，被认为是更安全的基因编辑方式。
 
然而，在实际应用中，尤其是向体内递送碱基编辑器时存在着一些挑战。体内基因编辑最常用、最高效的递送载体是腺相关病毒（AAV），然而，AAV的装载能力有限，仅4.7kb，碱基编辑器超过了AAV的装载限制，目前采用的策略是通过两个单独的AAV分别递送碱基编辑器的编码序列的一部分，然后让其在递送后翻译并组装成完整的碱基编辑器。这种双AAV载体的递送策略，有两个明显的不足，一是降低了基因编辑效率，二是需要更高的AAV剂量，而高剂量AAV可能会导致免疫原性和肝毒性。这在一定程度上限制了碱基编辑技术的临床应用和发展。
2022年7月28日，碱基编辑技术开创者刘如谦（David Liu）团队在 Nature 子刊 Nature Biomedical Engineering 发表了题为：Efficient in vivo base editing via single adeno-associated viruses with size-optimized genomes encoding compact adenine base editors 的研究论文。
 
刘如谦团队开发了一套紧凑型腺嘌呤碱基编辑器，能够使用单AAV载体递送并在肝脏、心脏、肌肉等组织中实现高效碱基编辑，编辑效率优于双AAV载体。
 
对人PCSK9基因（人源化小鼠）、小鼠Pcsk9基因和Angptl3的体内编辑显示，能够降低目标蛋白水平90%以上，同时血浆胆固醇和甘油三酯也显著降低。
这项研究提高了碱基编辑的治疗潜力，确立了单AAV碱基编辑器系统的优势，并提供了一套具有广泛靶向能力的单AAV腺嘌呤碱基编辑器，以支持高效的体内碱基编辑。
基因编辑技术的出现为那些原本无药可医的遗传性疾病带来了希望，近年来，多项人体临床试验也证明了以CRISPR为代表的基因编辑技术的潜力。
使用基因编辑技术研究和治疗遗传疾病，通常需要在体内进行编辑，因此，将精确的基因编辑组分有效递送到动物体内，是推进基因编辑技术应用到临床的关键步骤。
腺相关病毒（AAV）已被用于在人类疾病动物模型、临床试验中，而且美国食品和药品监督管理局（FDA）也已经批准几款通过AAV递送编码治疗性蛋白质的基因疗法。由于其递送效率、良好的安全性、组织特异性等优点，AAV已经成为目前最重要的体内递送载体。
 
与CRISPR-Cas9等基因编辑不同，碱基编辑器（Base Editor）不依赖于DNA双链断裂，因此几乎不会产生前者的基因插入或缺失、染色体缺失或易位、染色体非整倍体、染色体碎裂等潜在副作用。
 
然而，碱基编辑器（Base Editor）的尺寸超过了AAV的4.7kb的装载限制。而且，除了碱基编辑器本身，还需要gRNA、启动子序列、顺式调控元件，单个AAV载体难以装载。为了解决这个问题，目前通行的做法是将编码碱基编辑器的DNA分别装载到两个AAV中，即双AAV系统。
 
如果能开发出单AAV碱基编辑系统，将大大简化碱基编辑器的应用、表征和制造，还能提高编辑效率、降低所需的AAV剂量，从而减少潜在的毒性副作用。
腺嘌呤碱基编辑器（ABE）是一类特别有用的碱基编辑器，ABE能够介导 A·T → G·C 的转换，而这一转换可以修正大约一半已知的单碱基突变导致的疾病。
 
2020年3月，刘如谦团队使用噬菌体辅助连续进化（PACE）开发出了更高效的腺嘌呤碱基编辑器——ABE8e，ABE8e仅包含单个TadA脱氨酶结构域，因此尺寸更小。
在这项最新研究中，刘如谦团队构建了小型化的、高活性的ABE8e变体——saABE8e，并确定了AAV基因组上最少的必要性顺式作用元件，以开发具有广泛体内靶向能力的高效单AAV载体。
然后，刘如谦团队使用三种紧凑型的CjCas9（2.95kb）、Nme2Cas9（3.24kb）和SauriCas9（3.18kb） 来进一步开发ABE8e变体，以实现使用单个AAV载体递送腺嘌呤碱基编辑器，这些变体具有广泛的PAM序列兼容性，原则上可对人类基因组中约82%的腺嘌呤进行碱基编辑。
接下来，研究团队使用这些单AAV载体碱基编辑器在小鼠体内进行了验证实验，使用AAV8型递送这些碱基编辑器，分别编辑人PCSK9基因、小鼠Pcsk9基因、小鼠Angptl3基因。实验结果显示，在肝脏中的编辑效率平均为50%左右，靶蛋白水平更是下降了90%以上，此外，总胆固醇和甘油三酯也显著降低。

PCSK9和Angptl3基因是已知的心血管疾病相关风险基因，降低这两个基因的表达，均能降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，从而预防和治疗心血管疾病。

该研究通过优化腺嘌呤碱基编辑器和AAV病毒载体组件的大小，开发了一套单AAV腺嘌呤碱基编辑系统，能够实现强大的体内碱基编辑，而且具有广泛的PAM序列兼容性。这一单AAV碱基编辑系统在肝脏、心脏和肌肉组织中分别可实现高达66%、33%、22%的碱基编辑效率，优于双AAV载体。当与双AAV载体同剂量时，单AAV载体递送的编辑效率在心脏中增加2.1倍，在肌肉中增加2.5倍。

此外，单AAV腺嘌呤碱基编辑系统可以使用多种血清型的AAV（该研究中使用了AAV8和AAV9），这有助于在肝外组织进行递送。对于脂质纳米颗粒（LNP）递送最有效的肝脏，该单AAV腺嘌呤碱基编辑系统的效果与之相当，而对于心脏等LNP无能为力的器官，单AAV腺嘌呤碱基编辑系统将大有可为。

与目前使用的双AAV载体策略相比，该研究开发的单AAV腺嘌呤碱基编辑系统的优势很明显，只需生产单个AAV载体，能够提高效率、降低复杂性，减少给药剂量，从而降低潜在毒性作用。

总的来说，这项研究提高了碱基编辑的治疗潜力，确立了单AAV碱基编辑器系统的优势，并提供了一套具有广泛靶向能力的单AAV腺嘌呤碱基编辑器，以支持高效的体内碱基编辑。

 
论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41551-022-00911-4
https://www.nature.com/articles/s41587-020-0453-z
本文转载自：生物世界