骨关节炎(Osteoarthritis, OA)是一种常见的退行性关节疾病,严重影响全球数百万患者的生活质量,目前尚无根治的方法,现有疗法主要用于缓解疼痛或进行关节置换手术。

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β-catenin和Indian hedgehog (Ihh) 信号通路在OA的发生发展中起重要作用,过度激活这两条通路会导致关节组织的退变和骨赘的形成。虽然传统的CRISPR/Cas9基因编辑技术在OA研究中展现出了巨大的潜力,但它也可能带来一些风险,比如导致不可逆的DNA双链断裂以及染色体重排等。因此,基于RNA的干扰方法正逐渐受到更多关注。

CRISPR/Cas13家族是一种新兴的RNA编辑工具,CasRx (RfxCas13d) 是该家族中一种高效且特异性强的亚型,可实现精准的单链RNA降解,而不会对DNA造成永久改变。

近期,中科院深圳先进技术研究院陈棣教授团队在医学和遗传学一区期刊Genes & Diseases 杂志发表题为CRISPR/CasRx-mediated RNA knockdown targeting β-catenin and Ihh signaling alleviates osteoarthritis文章,通过采用CRISPR/CasRx技术同时靶向Ctnnb1 (编码β-catenin) 和Smo (Ihh信号传导所需的受体),首次在体内验证了CRISPR/CasRx技术在骨关节炎治疗中的应用潜力。

研究亮点
1.高效且特异的RNA靶向降解:研究筛选出Ctnnb1Smo基因的最佳crRNA组合,CasRx介导的RNA敲低在体外和体内均表现出高效且特异的效果,同时未检测到明显的脱靶效应。2.AAV载体递送技术:用AAV5载体将CasRx和crRNA递送至OA小鼠模型的关节组织中,实现了持久表达,并有效抑制了目标基因的表达。

3.联合靶向显著抑制OA进展:同时靶向Ctnnb1Smo的crRNA组合显著减少了OA相关关节结构损伤,降低了软骨缺损面积和骨赘体积。

 

研究思路与方法
1.crRNA筛选与验证:共设计20条靶向Ctnnb1Smo的crRNA,并在NIH 3T3细胞中验证其效率和特异性。2.脱靶分析:用转录组测序评估脱靶效应。

3.体内实验设计:通过Destabilization of Medial Meniscus (DMM) 手术建立OA小鼠模型。术后10天注射AAV5-CasRx-S9C7组合,连续3个月观察关节变化。使用Micro-CT和组织学染色评估关节损伤程度,包括软骨缺损、骨赘形成等。

 

主要研究结果
1.高效且特异性抑制Ctnnb1Smo表达:在NIH 3T3细胞中,靶向Ctnnb1的C7与靶向Smo的S9组合导致Ctnnb1Smo mRNA水平分别下降89.2%和88.7%,而潜在脱靶基因的表达水平无明显下降(图1)。

图1 CasRx在体外高效且特异性地敲低Ctnnb1和Smo转录本

2.关节保护效果:在DMM手术组小鼠中,CasRx-S9C7治疗组的关节结构损伤显著减轻(图2):

  • OARSI评分显著降低,提示软骨缺损面积减少;
  • 骨赘体积显著减小,关节软骨中Col2a1表达水平上调,提示软骨基质代谢恢复。

图2 CasRx介导的Ctnnb1和Smo敲低阻止了骨关节炎(OA)膝关节的退变

3.减少炎症因子表达:MMP13和Adamts5等基质降解酶的表达水平显著降低(图3),提示该技术在抑制OA相关炎症方面的潜力。

图3 CasRx介导的基因敲低降低了组织中骨关节炎(OA)相关因子的表达水平

研究结论
本研究首次在体内验证了CRISPR/CasRx技术在骨关节炎治疗中的应用潜力。结果显示,通过靶向抑制Ctnnb1和Smo信号传导,可有效减缓OA进程,并减少关节软骨和骨组织的损伤。该方法的优势在于:(1)可实现多基因靶向;(2)不直接改变DNA序列,因此减少了永久性遗传改变的风险,同时降低了脱靶效应的可能性;(3)灵活,RNA编辑的效果是可逆的,这为临床应用提供了更多的安全保障。
  
展望与意义
本研究为基于CRISPR/CasRx技术的RNA靶向干扰策略在关节退行性疾病治疗中提供了新的思路,具有潜在的临床应用前景。未来的研究可进一步探索其在其他组织或疾病模型中的效果,并优化递送系统以提高靶向效率。派真很荣幸为本研究提供了AAV病毒包装服务,派真CRO &CTDMO 一站式服务平台,提供从基因合成、载体构建,到病毒包装的整体解决方案,全面支持您的基因编辑研究。我们还提供多种现货AAV产品