腺相关病毒（AAV）作为一种重要的基因传递和表达工具，近年来在科学研究和基因治疗领域得到了广泛的应用。作为一种基因导入系统，AAV病毒载体具有安全性好，免疫原性低，能感染分裂细胞和非分裂细胞，能介导基因的长期稳定表达等优点，这些性质使AAV成为理想的基因载体。
1、AAV病毒使用过程中是否会存在生物安全问题？
目前为止，还没有发现 AAV 对人体致病。有数据报告每 10 个人中就有 8 个人在一生中会感染 AAV，但并不会引起相关疾病发生。而我们一般使用的是重组型 AAV （rAAV），更是去除了 96% 的野生型AAV 基因组，进一步确保了安全性。rAAV一般不具备复制能力并且宿主基因组整合率低，分子量小、免疫原性极低，因此安全性高。不仅应用于动物研究，即使是用于临床也是安全性非常高的一种病毒载体，rAAV在基因治疗上的临床应用就是很好的例子。另外，NIH也指出AAV属于RG1类生物制剂，即低风险的、与人类和动物疾病无关的生物制剂。因此，在AAV的实验操作中注意常规的安全防护和消毒即可。
2、AAV的血清型是什么意思？
AAV血清型是是指包裹遗传物质的蛋白质外壳，也就是衣壳蛋白，由Cap基因编码，这是病毒识别和结合细胞表面受体的关键。不同血清型的区别就在于衣壳蛋白的氨基酸序列和空间结构的差异，进而使得不同血清型对特定组织或细胞具有不同的嗜性。AAV血清型可以直接表示为例如AAV2、AAV5、AAV9等，另外需要明确的一点是目前几乎所有重组AAV病毒载体的核心骨架都是来源于AAV2亚型，所以完整的AAV血清型可以表示为例如AAV2/2、AAV2/5、AAV2/9等。
3、特异性AAV血清型和特异性启动子？有什么作用？
AAV血清型是针对病毒感染特性而言的，而特异性启动子的作用是在于病毒感染后的基因表达层面。通常所说的特异性启动子是指组织特异性启动子或器官特异性启动子，它是来源于只在某些特定组织或器官表达的基因的启动子，且该启动子的活性较好，在其特异性表达功能的加持下使得具有特异性血清型的AAV靶向性更强。然而需要清楚的一点是，生物体内细胞表达调控非常复杂，实际应用过程中并非所有特异性启动子会都严格遵循表达特异性，在某种程度上讲可以定义为相对特异性，所以有时候在动物实验中发现一些非靶标组织上也有相关基因表达也是有可能的，属于启动子表达泄露事件。这种情况下可以尝试通过组织原位注射来进一步增加靶向特异性。
4、AAV注射动物后一般多久可以观察效果？
AAV属于单链DNA病毒，感染细胞后需要在胞内形成双链DNA形式才能进行基因表达，这个过程一般比较漫长，在注射病毒后1-2周才开始表达，但此时的表达量比较低，还不适于取材检测，通常是建议3-4周后再后续的检测。想要快速表达的AAV可以选择scAAV，即DNA为双链的自互补AAV，与标准单链ssAAV相比，scAAV载体不需要单链DNA复制成为双链DNA的步骤就可以进行转录，所以基因表达更为迅速，可以在注射后3-5天达到表达高峰，而且表达量更高。但是，它们的包装容量（<2.5Kb）是ssAAV的一半（<4.8Kb），限制了可以成功包装的基因和载体可以有的调控元件的数量。
5、AAV用于动物感染时如何提高感染效率？
排除动物本身状态的影响外，单从AAV使用角度看，我们需要依据感染的目标，然后通过查询参考文献和病毒使用说明，去选择合适的AAV血清型、注射方式、注射位点以及注射量。一般使用滴度较高的AAV比同等量滴度低的AAV效果会更加。
6、在动物体内注射AAV后，并未达到理想的效果，或是甚至检测不到目的基因的过表达或敲低，会有哪些原因呢？
这一问题涉及的可能性比较多，需要一一排除，综合考虑各方面影响因素：
（1）病毒问题：外源基因序列大小是否在AAV的包装容量内，AAV的包装容量通常不超过4.7kb，在除去启动子、荧光标签和蛋白标签等元件后，实际上外源基因的容量一般在2kb以下。再者，病毒滴度是否符合要求，建议保存半年以上的病毒最好重新测定下滴度再使用。还有在保存方式要得当，避免反复冻融，计划一周内用完可以放置4℃保存，长期保存需分装后于-80℃保存。
（2）组织/细胞特异性问题：前面的问题也提到了AAV具有不同组织嗜性的血清型、可以携带特异性启动子、不同组织部位的注射方式可能不同、注射量不同，这些都是AAV感染效率和表达特性的重要影响因素。
（3）检测时间问题：检测时间点是否处于AAV表达高峰的时间段，过早或过晚做检测都有可能达不到理想效果。
（4）目的基因的本底表达水平：构建AAV以调控基因表达前，是否检测过目标组织或细胞中目的基因的本底表达水平，本底表达较高做过表达、本底表达较低做干扰很可能观察不到调控效果。
（5）取材方式问题：动物组织或细胞的取材时间、方式、保存条件是否合适，比如选择石蜡切片还是冰冻切片；如果要具体检测到某一种细胞，可以通过流式分选等方法把目标细胞从组织中分离出来再做检测。
（6）检测方式问题：检测目的基因的表达水平通常是做qPCR（mRNA水平）和WB（蛋白水平），其中要考虑的一个问题是AAV预计感染的是整个组织还是组织中的某种细胞，后者就要分离出目的细胞后做表达水平的检测，此外检测中使用的试剂、引物、抗体的质量也在考虑的范围内。如果AAV带有荧光标签，还可以通过活体成像和组织冰冻切片直接观察荧光以反映感染效率。建议使用不同方法、不同层面检测AAV感染效率和目的基因调控效果。
（7）组织细胞自身的调控因素影响：事实上，绝大多数情况下mRNA和蛋白表达水平之间并不是一种线性的关系，这个过程中涉及翻译调控、蛋白修饰、蛋白半衰期等因素影响。另外，还可能出现代偿性表达升高或下调的趋势导致检测不到蛋白的显著变化。
（8）其他问题：实验动物的选择和健康状态是否满足需求、实验操作技术是否熟练以及仪器的正确使用等也是影响实验成败的关键。
7、AAV感染动物后，为什么会观察不到荧光或荧光微弱？
这里除了要关注问题6的因素外，还要考虑荧光蛋白的特性，例如荧光蛋白的亮度、稳定性等。制作组织切片过程中使用的有机溶剂有可能会改变荧光蛋白的结构，导致荧光淬灭；GFP在酸性环境中易淬灭。
8、腺相关病毒(AAV)可以用于基因组编辑吗？
通过AAV利用Crispr/Cas9技术做在体敲除，需要解决的一个问题是如何有效装载基因编辑工具。目前已经有很多基因更小的Cas蛋白被发现，例如SaCas9（Staphylococcus aureus Cas9），Nme2Cas9（Neisseria meningitides Cas9）等，这些Cas蛋白可有效装载到AAV载体，达到在体靶向基因编辑的作用。另一种方法是运用cre-loxp系统进行的敲除，前提是必须要有flox动物，再配合AAV-cre使用即可实现靶基因的敲除。
9、需要对动物进行造模，什么时间注射AAV合适？
AAV的表达高峰在注射后3-4周，然后结合动物造模的时间、注射AAV的目的来推算注射时机。比如AAV调控基因表达进而起治疗作用，则一般要把控AAV的表达高峰期与造模过程同步；如果是起预防作用，那么可能就要在造模前或造模早期使AAV处于表达高峰期。当然，还是需要具体问题具体分析，根据模型特点来判断。需要注意的是，AAV的表达高峰期能维持多久是没有一个具体时间范围的；如果造模时间较长，可以在首次注射后1-2个月补打一次来维持长时间的高表达状态。
10、AAV能不能用于体外细胞感染呢？
一般情况下，我们不推荐使用AAV直接体外感染细胞。虽然AAV 可以保持基因长期转录表达，但通常体外细胞系的增殖速度较快，导致感染至细胞中的 AAV 会随着细胞分裂不断稀释，进一步导致其表达水平降低从而限制了AAV的表达能力。如果一定要用于体外细胞感染，最好使用特异性血清型（例如AAV-DJ型别），且感染过程需要用很高的MOI（104~106）进行感染，具体需要预实验摸索。
