本文将讨论 AAV 的各种血清型、感染、组织和器官的趋向性的一些特性、以及对许多人类疾病的功效等。
AAV 的发现简史
AAV 是属于细小病毒科的小型无囊膜 DNA 病毒，于 1965 年首次分离出来，作为猿猴腺病毒 (Ad) 制剂中的污染物。这些病毒被发现无法有效地感染细胞，除非与辅助病毒（通常是 Ad 或任何类型的疱疹病毒）共同感染，因此它们被命名为“腺相关病毒”，并被分类为依赖病毒属。由于相互依赖性而长期被认为是有缺陷的病毒，后来对 AAV 的研究反驳了这一理论，并表明它们在宿主细胞中发起潜伏感染，在压力下可以转化为生产性感染。尽管 AAV 在人类中具有较高的血清阳性率（据估计，根据年龄和种族群体，50% 至 96% 的人群对 AAV血清型2 (AAV2) 呈血清阳性），然而，无论是在人类还是在任何其它物种中，都与任何疾病无关。不同的 AAV 不仅在灵长类动物中分离检测到，还在禽类、山羊、牛和马科动物中检测到。
AAV 的特性、结构和基因组
除了 AAV5 差异最大之外，所有 AAV 都具有相似的结构和特性。AAV 易于操作，因为它们的颗粒可以在极端的 pH 和温度条件下保持生物稳定性。它们共享约 4.7 kb 单链 DNA 的基因组，包装在直径为 20-25 nm 的二十面体、无囊膜衣壳中。AAV 基因组主要由两个病毒基因组成：rep（复制）和 cap（衣壳），两侧是反向末端重复序列 (ITR)。由于ITR具有回文核苷酸序列，它们产生特征性的T形发夹结构，为病毒基因组复制和包装提供必要的结构元件。ITR 还在病毒基因表达和宿主基因组整合中发挥调节作用。rep 的开放阅读框 (ORF) 编码基因调控、复制、转录和衣壳化所需的几种非结构蛋白，而 cap 的 ORF 编码三种结构蛋白：病毒体蛋白 1 (VP1) 、VP2 和 VP3，在AAV 颗粒中的摩尔比为 1:1:10。不同 AAV 血清型的不同组织向性是由于该cap ORF 的加工差异造成的，从而导致不同的免疫和转导谱。
AAV 血清型和趋向性
根据其血清型，AAV 对身体的特定器官和组织具有特定的趋向性。AAV 有不同的血清型，它们在许多方面都有所不同。接下来，本文将分别讨论每种血清型。图 1 展示了它们的不同趋向性。
AAV 血清型的不同趋向性。
AAV1
AAV 血清型1 (AAV1) 的确切起源仍然未知，因为它最初并不是从组织中分离出来的，而是作为 Ad制剂的污染物，并且在人类和非人类灵长类动物（NHP）体内都发现了其抗体。该血清型使用唾液酸作为其主要细胞表面受体，并使用AAV受体（AAVR）作为辅助受体。根据 Rabinowitz J.E. 等人的说法，AAV1 不结合肝素，因为它缺乏 R585 和 R588（这种结合所需的氨基酸残基），因此无法使用肝素进行纯化。Zolotukhin S. 等人开发了一种通过碘克沙醇梯度离心和阴离子交换层析法进行 AAV1 层析纯化的方案。它也可以使用粘蛋白柱进行纯化，因为它可以结合粘蛋白中的唾液酸残基。此外，根据 Mary B. 等人对 10 种 AAV 血清型进行的系统分析，重组 AAV1 (rAAV1) 未发现任何可检测到的翻译后修饰 (PTM)。它是第一个被批准用于基因治疗的病毒载体。1999年，Xiao W.等人进行了一项研究，研究用于基因治疗的病毒载体，结果发现AAV1是骨骼肌转导最有效的血清型。此后许多研究证实，与其它血清型相比，AAV1 对鼠科动物、犬科动物和 NHP 来源的骨骼肌具有高度趋向性。AAV1 还被发现可以实现小鼠大脑中神经元、神经胶质细胞和室管膜细胞的有效转导。此外，它被发现能够有效地传导心脏、内皮和血管平滑肌以及视网膜。
AAV2
AAV2 被认为是所有 AAV 中研究最多的血清型。它于 1965 年首次被发现，是猿猴 Ad 制剂中的污染物。后来，在 1998 年，Summerford C. 和 Samulski R.J. 发现了它的主要细胞受体硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 (HSPG)，随后提出提供其与 HSPG 亲和力的氨基酸残基为 R585 和 R588。因此，rAAV2 可以使用肝素柱亲和层析进行纯化。然而，AAV2与其主要受体的结合被发现不足以进入细胞，因此后来鉴定了它的几个辅助受体，包括人成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）、αVβ5和α5β1整合素、肝细胞生长因子受体（HGFR）、层粘连蛋白受体（LR）和CD9。据报道，rAAV2 的衣壳获得了多个 PTM，包括泛素化、磷酸化、SUMO 化和多位点糖基化。作为研究最多的血清型，AAV2 事实上对 NHP、鼠、犬、禽和人类细胞类型的多种组织表现出多种趋向性，包括肾组织、肝细胞、视网膜、中枢神经系统（CNS）的非有丝分裂细胞和骨骼肌。尽管如此，AAV 嵌合体和交叉包装（或交叉分型）的进一步创新使 AAV2 具有更广泛的组织趋向性，其中一种血清型的病毒基因组可以包装到衣壳中另一种类型，提供更广泛的转导谱。
AAV3
AAV 血清型3 (AAV3) 最初是从人类中分离出来的。与 AAV2 类似，该血清型使用 HSPG、FGFR1 和 LR 受体，以及人类 HGFR (hHGFR) 受体。碘克沙醇梯度超速离心和离子交换层析已用于 AAV3 纯化。rAAV3 衣壳的 PTM 包括乙酰化、磷酸化和糖基化。由于其在体外和小鼠细胞系中的转导效率不足，AAV3 作为基因治疗的选择大多被忽视。然而，由于后来发现使用 hHGFR 作为辅助受体，它对人类肝癌细胞以及人类和 NHP 肝细胞表现出极其有效的转导。自从发现 AAV3 的这种选择性趋向性以来，各种研究旨在优化策略以生成具有更高转导效率的 rAAV3 载体。开发的策略提出了不同的方法，主要是 AAV3 载体的衣壳修饰和 hHGFR 表达水平的修饰，以及与其相关的酪氨酸激酶活性。AAV3 还被发现对耳蜗内毛细胞具有特异性趋向性，在小鼠模型中显示出较高的体内转导效率。
AAV4
AAV 血清型4 (AAV4) 被认为是抗原性最独特的血清型之一。据报道，它起源于 NHP，主要是非洲绿猴，因为在它们的血清中检测到了其病毒颗粒的抗体。对AAV4结构的研究表明，其衣壳表面拓扑结构与人类细小病毒B19和阿留申水貂病病毒的衣壳表面拓扑结构具有显著相似性。AAV4使用a-2,3-O-连接的唾液酸进行细胞结合和感染；因此，基于其结合粘蛋白中唾液酸残基的能力，粘蛋白柱可用于 AAV4 纯化。此外，由于该血清型缺乏肝素结合活性，因此不能像 AAV2 那样使用肝素柱亲和层析进行纯化，但离子交换层析方案已被开发出来，并被证明具有较高的纯化效率。rAAV4 唯一报道的 PTM 是其衣壳蛋白的泛素化。AAV4 被认为能够转导人类/NHP 细胞以及小鼠和犬科动物来源的细胞。AAV4 的特异性趋向性导致哺乳动物中枢神经系统（CNS）中特定细胞类型（主要是室管膜细胞）的转导功效。此外，在视网膜下递送后，AAV4 表现出对啮齿动物、犬科动物和非人灵长类动物模型的视网膜色素上皮 (RPE) 细胞的稳定转导，这是其衣壳的特异性所实现的独特特征。在小鼠模型中，AAV4 还显示出对肾、肺和心脏细胞的显著转导率。
AAV5
由于 AAV5 于 1983 年首次从男性生殖器病变中分离出来，因此成为唯一直接从人体组织中分离出的 AAV 血清型。该血清型被认为是所有 AAV 中遗传差异最大的，具有各种独特的特征，例如其 ITR 区域的不同大小和功能，利用单纯疱疹病毒 (HSV) 作为人类感染的辅助病毒，并使用非典型内吞途径作为病毒进入的途径。AAV5 的另一个显著特征是它能够转导 AAV2 无法转导的细胞，这是基因治疗用途的独特优势。还发现 AAV5 使用唾液酸作为其主要受体，以及血小板衍生生长因子受体 (PDGFR) α 和 β 作为辅助受体。与 AAV1 和 AAV4 类似，粘蛋白柱可用于 AAV5 纯化，并且离子交换层析方案也已为此目的而开发。据报道，rAAV5 的衣壳蛋白经历多种 PTM，包括泛素化、磷酸化、SUMO 化和糖基化。AAV5 被证明对小鼠视网膜细胞具有显著的转导效率，主要是感光细胞。此外，AAV5的趋向性已在小鼠大脑中进行了研究，结果证明其具有多种神经细胞类型的转导能力，包括浦肯野细胞、星状、篮状和高尔基体神经元，并且能够到达下层神经细胞丘和心室上皮。AAV5 还因其通过顶端感染有效转导小鼠气道上皮、血管内皮细胞和平滑肌而闻名。据报道，它对小鼠肝细胞也有趋向性。
AAV6
AAV 血清型6（AAV6）的分类仍然存在争议，因为它与 AAV1 和 AAV2 血清型都具有高度的基因组相似性，但是，它仍然有自己的血清型编号。AAV6 的血清学特征与 AAV1 几乎相同，其编码区序列同源性高达 99%，并且多个区域与 AAV2 相同。因此，它被认为是 AAV1 和 AAV2 之间同源 RECOMation 产生的天然杂种。AAV6首先从人类Ad制剂中分离出来，与AAV1类似，被发现结合唾液酸化蛋白聚糖，主要是α2,3-/α2,6-连接的唾液酸，作为其主要受体，并结合硫酸乙酰肝素。至于其辅助受体，它结合表皮生长因子受体（EGFR）。rAAV6 唯一报道的 PTM 是其衣壳蛋白的乙酰化。与之前描述的血清型类似，AAV6 可以通过肝素或粘蛋白柱亲和层析进行纯化，因为它可以结合两者。据报道，AAV6对多种组织具有趋向性，包括小鼠和犬模型的气道上皮、小鼠肝细胞以及小鼠和犬模型的骨骼肌，转导效率甚至高于AAV2，此外，也可转导小鼠、猪、犬和绵羊模型中的心肌细胞。
AAV7
AAV 血清型7 (AAV7) 于 2002 年首次从 NHP 组织中分离出来，特别是从恒河猴中分离出来。其细胞结合和细胞进入的机制仍然未知，但已确定该血清型一般不结合肝素或任何其它聚糖。rAAV7 的衣壳蛋白经历多种 PTM，主要包括糖基化，以及磷酸化、SUMO 化和乙酰化。Calcedo R等人的一项研究调查了全球人群中AAV中和抗体的流行病学，发现AAV7抗体在人类中的血清阳性率相对较低，这是该血清型在临床应用中的一个优势。基于AAV7的病毒载体在小鼠模型中证明对骨骼肌细胞具有很高的转导效率，与AAV1所达到的效果相似，并且高于AAV2。该血清型也被证明对鼠和人组织中的肝细胞具有强烈的趋向性。在 NHP 的 CNS 中，发现 AAV7 病毒载体主要在皮质和脊髓组织中实现稳健的转导。此外，据报道，基于 AAV7 的病毒载体可以在体内和体外实现小鼠神经元和视网膜感光细胞的显著高转导率。AAV7 载体似乎对血管内皮细胞也具有有限的趋向性，可以通过蛋白酶体抑制相对增强，并且对小鼠心脏组织中的心外膜细胞具有体内转导偏好。
AAV8
与 AAV7 类似，AAV 血清型8 (AAV8) 于 2002 年首次从恒河猴中分离出来。作为主要受体，AAV8 结合 LR，与 AAV2 和 AAV3 使用的受体相同。自 AAV8 发现以来，已经开发了多种快速且可放大纯化的方法，包括双离子交换层析法或碘克沙醇梯度离心。磷酸化、糖基化和乙酰化是 rAAV8 衣壳蛋白报道的三种 PTM。AAV8 以其对肝细胞的强烈趋向性而闻名，因此其肝细胞转导效率远高于不同模型中所有其它 AAV 血清型（包括小鼠、犬科动物和 NHP）的转导效率。在小鼠模型中进行全身递送后，AAV8 被证明是骨骼肌和心肌转导最有效的血清型，因为它能够穿过血管屏障，而 AAV1 和 AAV6 都缺乏这一功能，从而限制了它们的肌肉递送效率仅转导至局部。AAV8 还可以在局部递送后成功实现小鼠胰腺细胞的体内转导。此外，通过将 AAV8 病毒载体局部直接递送到肾组织中，可以实现小鼠肾细胞的高速率转导。还发现 AAV8 可以实现小鼠视网膜中不同细胞的有效转导，包括无长突细胞、Müller 细胞和假定的双极细胞，以及一些水平细胞和神经节细胞层 (GCL) 中的细胞。AAV8 转导效率似乎对某些组织中的蛋白酶体水平敏感，因此可以使用蛋白酶体抑制剂来提高。
AAV9
AAV 血清型9 (AAV9) 于 2004 年首次在人类分离株中被发现，并被命名为新血清型，因为它具有与之前已知的 AAV 不同的血清学特征，但有人认为它与含有 AAV7 和AAV8的进化枝密切相关。作为主要受体，AAV9 使用末端 N 连接半乳糖，并且还提出结合假定的整联蛋白，以及 LR 作为辅助受体。已经开发出用于 AAV9 纯化的可放大的简单纯化方案，包括离子交换层析法和蔗糖梯度离心。rAAV9 的衣壳具有最高的 PTM 总数之一，包括多重泛素化、磷酸化、SUMO 化和糖基化修饰以及乙酰化。在大多数组织中，AAV9 似乎能够以优于其它 AAV 的效率实现细胞转导。例如，在一项旨在调查小鼠模型中全身递送后 AAV1-9 分布的研究中，与所有其它 AAV 相比，AAV9 表现出快速起效、最佳的基因组分布以及最高的蛋白质水平。此外，在鼠、NHP和猫模型的中枢神经系统中，与其它血清型相比，它具有独特的特征，因为它可以穿过血脑屏障，不仅可以转导神经元细胞，还可以转导其它AAV通常无法转导的非神经元细胞，包括星形胶质细胞，也显示出对视网膜感光细胞的趋向性。基于 AAV9 的病毒载体也被证明比 AAV1 和 AAV8 病毒载体对于小鼠、NHP 和猪心肌转导更有效（在某些情况下比 AAV8 高 5-10 倍）， AAV9 的特点是能够穿越血管系统内皮细胞的物理屏障。Inagaki K 等人的一项研究提出了 AAV9 优于其它 AAV 的另一个例子，其中该血清型实现了小鼠肝细胞、骨骼肌和胰腺细胞的稳健转导。基于 AAV9 的病毒载体似乎也对鼠感光细胞、肾小管上皮细胞、睾丸间质组织中的 Leydig 细胞以及肺泡和鼻上皮细胞具有亲和性。
AAV10 和 AAV11
AAV 血清型10和11（AAV10 和 AAV11）于 2004 年首次在 NHP 分离株（即食蟹猴）中发现和描述，其衣壳蛋白分别与 AAV8 和 AAV4 非常相似，导致与这两种血清型的血清学交叉反应。然而，未发现针对 AAV10 和 AAV11 的抗血清与 AAV2 的血清有任何交叉反应性，这表明它们是对具有针对 AAV2 抗体的个体进行基因治疗的良好病毒载体候选者。目前尚不清楚 AAV10 和 AAV11 使用什么细胞受体和辅助受体来进行细胞结合和进入；因此，描述其纯化方案的策略通常基于碘克沙醇梯度离心。与 AAV9 类似，rAAV10 的衣壳具有最高的 PTM 总数之一，主要包括多种糖基化和磷酸化修饰，以及泛素化、SUMO 化和乙酰化。一项调查 AAV10 和 AAV11 在猴子体内生物分布的研究表明，它们倾向于 NHP 肠细胞、肝细胞、淋巴结，较少倾向于肾细胞和肾上腺。AAV10 也被认为对小鼠小肠和结肠细胞具有趋向性。与AAV8和AAV9相比，AAV10似乎对鼠视网膜细胞具有最大的趋向性范围，因为据报道它可以转导多种细胞类型，包括RPE、神经节细胞层中的细胞、内核层中的几种细胞类型、光感受器以及水平细胞。静脉注射后，AAV10被发现靶向小鼠肝细胞和肺细胞，然而，在局部递送后，它转导小鼠肾细胞和胰腺细胞。至于AAV11，发现它对NHP CNS有轻微的趋向性，主要是大脑和脊髓。最近一项使用 rAAV11 进行神经基因治疗的研究发现，这种血清型也可以靶向小鼠投射神经元和星形胶质细胞。
AAV12
AAV 血清型12（AAV12）首先从猿猴 Ad 种群中分离出来，然后被定性为一种新型血清型，因为它表现出独特的生物学和血清学特性。尽管已证明 AAV12 不使用硫酸乙酰肝素蛋白聚糖或唾液酸来附着和进入细胞，但它如何准确地结合靶细胞仍不清楚。然而，根据一项研究 AAV12 潜在受体复合物成分的研究，甘露糖和甘露糖胺被认为是这种复合物的成分，因为它们抑制 AAV12 细胞转导。此外，AAV12 对人类抗体的中和具有抵抗力，是人类基因治疗应用的良好候选者。AVB Sepharose 亲和层析已用于纯化 AAV12。在小鼠模型中，它显示出对唾液腺和肌肉的趋向性。鼻内给药后，它还显示出对小鼠鼻上皮的强烈、局部的体内趋向性。
AAV13
AAV 血清型13 (AAV13) 是另一种似乎与 HSPG 结合的猿猴 Ad，尽管其主要细胞受体仍然未知。它还被发现与 AAV2 和 AAV3 具有结构相似性，使其成为与这两种血清型最相关的 AAV，其衣壳保留了所有 AAV 衣壳的结构特征，但有关这种血清型趋向性和转导效率的数据有限。
新型杂交 AAV 载体
除了上述天然 AAV 血清型外，在过去二十年中还开发了新型 AAV 载体，并且仍在开发中。使用不同的工程策略，已经产生了新型杂交载体，以增强其转导、调节其免疫原性或限制其对特定细胞的趋向性。这种工程化的新型载体有不同类型，包括镶嵌、嵌合和组合载体库。嵌合载体的衣壳中有多种不同血清型的亚基，根据其受体结合和细胞内运输的特性进行选择。在嵌合病毒体中，衣壳通常具有通过结构域交换和 DNA 改组策略生成的修饰蛋白，以改变特定氨基酸。组合载体文库还使用 DNA 改组和易错 PCR 方法来生成具有混合基因组的新型血清型 AAV 文库。
