Nat Biomed Eng | 耶鲁大学陈斯迪团队报道Cas12a基因敲入小鼠在多重基因组编辑、疾病建模和免疫细胞工程中的应用

Cas12a基因敲入小鼠在多重基因组编辑、疾病建模和免疫细胞工程中的应用

研究概述

2025年3月20日，耶鲁大学助理教授陈斯迪博士在Nature Biomedical Engineering期刊发表标题为“Cas12a-knock-in mice for multiplexed genome editing, disease modelling and immune-cell engineering”的研究论文，该研究主要开发了多种Cas12a基因敲入小鼠模型，这些小鼠模型能够实现多重基因编辑、疾病建模和免疫细胞工程，并为复杂基因相互作用的解析提供了强大的工具。

研究团队在C57BL/6背景的小鼠中，通过Rosa26位点插入LbCas12a或高保真增强型AsCas12a，构建了条件性或组成性表达Cas12a的小鼠模型。这些小鼠的Cas12a组成性表达未导致可辨识的病理变化，并且能够高效实现多重基因组工程。作者团队利用这些小鼠模型进行了多种应用，包括对CD4⁺和CD8⁺ T细胞、B细胞和骨髓来源的树突状细胞进行逆转录病毒介导的免疫细胞工程；通过腺相关病毒递送多个CRISPR RNA作为单个阵列，实现内源性癌症建模；以及利用脂质纳米颗粒靶向编辑肝脏组织。此外，本研究还开发了一个同时激活和敲除双基因（DAKO）的系统。

这些Cas12a基因敲入小鼠模型以及病毒和非病毒递送载体，为体外和体内基因编辑、疾病建模、免疫细胞工程以及复杂基因相互作用的解析提供了一个多功能的工具包。

导读

CRISPR（即“成簇的规律间隔的短回文重复序列”）在内源性基因编辑方面具有多种能力。CRISPR技术利用可编程的RNA来指导核酸内切酶的活性，从而以极高的精确度和简便性靶向任何DNA或RNA序列。Cas9基因敲入小鼠的出现使得体内癌症建模和原代免疫细胞中的遗传筛选成为可能，从而发现了许多关键的肿瘤生长驱动因子和免疫调节因子。尽管自CRISPR编辑时代开始以来，Cas9已被广泛使用，但Cas12a的出现带来了独特的优势，尤其是在多重基因编辑方面。除了具有DNA酶活性外，Cas12a还具有RNA酶活性，能够通过在直接重复序列（DR）共识序列处切割RNA，从串联的crRNA阵列中生成成熟的CRISPR RNA（crRNA）。这种多重基因扰动能力使其成为阐明复杂基因相互作用（如表观遗传性、冗余性、协同作用和拮抗作用）的理想候选者。

 

然而，Cas12a蛋白家族（长度为1200-1500个氨基酸）的较大尺寸在通过病毒载体（尤其是在原代细胞中）递送和稳定表达CRISPR-Cas12a系统方面构成了重大障碍。因此，作者认为开发Cas12a基因敲入小鼠将简化原代细胞基因组工程和基于Cas12a的CRISPR筛选过程。

 

Lachnospiraceae细菌（Lb）的Cas12a变体（LbCas12a）能够在癌细胞系中同时或顺序地扰动多个基因。LbCas12a酶与腺相关病毒（AAV）载体一起被用于高效地将嵌合抗原受体敲入人类原代T细胞的基因组位点，同时敲除潜在的检查点抑制因子。一种经过工程改造的AsCas12a版本，enAsCas12a（包含E174R/S542R/K548R替换）及其高保真版本enAsCas12a-HF1（包含E174R/N282A/S542R/K548R替换），已被证明具有扩展的PAM序列和增强的多重基因编辑效率。因此，开发具有稳定Cas12a基因敲入的小鼠品系，对于在原代小鼠细胞中实现高效的体内和体外多重基因组工程具有巨大潜力。

 

本研究描述了Cre依赖的条件性和组成性Rosa26位点基因敲入小鼠的生成，分别带有LbCas12a和enAsCas12a-HF1转基因。尽管在不同主要器官中高效检测到了Cas12a蛋白的表达，但具有Cas12a基因敲入和Cas12a蛋白组成性表达的小鼠并未表现出可观察到的毒性。利用LbCas12a小鼠，本研究在多种原代免疫细胞类型中展示了基因编辑能力，包括原代CD4⁺和CD8⁺ T细胞、B细胞和骨髓来源的树突状细胞（BMDCs），显示出DNA水平的基因编辑和蛋白质水平的减少。利用enAsCas12a-HF1小鼠（下文简称为enAsCas12a小鼠），除了在原代免疫细胞中进行体外多重基因扰动外，本研究还展示了利用多种递送载体（包括脂质纳米颗粒（LNP）-RNA、AAV和逆转录病毒载体）进行基因编辑的能力。通过将crRNA通过LNP递送至组成性enAsCas12a小鼠体内，本研究实现了转甲状腺素蛋白（TTR）的功能性敲除，其错误折叠形式会导致危及生命的转甲状腺素蛋白淀粉样变性。作者利用单个AAV载体同时靶向小鼠Trp53、Apc、Pten和Rb1基因，实现了体内四重基因敲除，迅速诱导唾液腺鳞状细胞癌（SCC）和肺腺癌（LUAD）的发生。最后，本研究通过将LSL-enAsCas12a小鼠与CRISPR激活（CRISPRa）转基因小鼠系（dCas9-SPH）整合，建立了一个同时激活和敲除双基因（DAKO）的系统。

  

正文

1. 条件性和组成性Cas12a基因敲入小鼠的生成

作者开发了LbCas12a和enAsCas12a基因敲入（KI）小鼠，以提高原代细胞中多重基因编辑的效率和简便性。作者将密码子优化的转基因克隆到Ai9 Rosa26靶向构建体中，以指导Rosa26位点第1外显子和第2外显子之间的重组（图1a）。

Cas12a的表达由CAG启动子驱动，但被下游的LoxP-3xPolyA-Stop-LoxP（LSL）盒中断，这使得基因组工程具有组织特异性（图1a）。为了提高Cas12a的编辑效率，作者在LbCas12a的N端和C端分别添加了SV40和核质素核定位信号（NLS），而在enAsCas12a中则使用了Egl-13和c-Myc NLS。此外，作者在Cas12a的C端融合了3xHA和Myc亲和标签，并紧随其后添加了2A自切割肽和增强型GFP（eGFP），以便通过Western blot和荧光显微镜检测Cas12a蛋白（图1a）。

为了生成组成性活性的LbCas12a和enAsCas12a小鼠品系，作者将LSL-LbCas12a和LSL-enAsCas12a小鼠与CMV-Cre小鼠杂交（图1b）。通过流式细胞术检测到enAsCas12a小鼠的原代耳成纤维细胞中GFP的表达（图1c），并通过Western blot验证了LbCas12a和enAsCas12a蛋白的表达（图1d）。

 

作者通过IVIS光谱定量了不同器官中Cas12a蛋白的GFP信号，发现大脑中的表达水平最高（图1e、f）。全血细胞计数（CBC）分析显示，enAsCas12a小鼠的红细胞计数略低，但在其他方面与野生型小鼠没有显著差异（图1g）。组成性enAsCas12a和LbCas12a小鼠在生育力和形态方面与野生型小鼠没有明显差异，并且能够繁殖并维持纯合性。

图1. 条件性和组成性LbCas12a和enAsCas12a基因敲入小鼠的生成。

为了进一步表征基因敲入小鼠品系，作者发现脾细胞的GFP信号水平与enAsCas12a转基因的拷贝数相符，且在不同淋巴细胞亚群（CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和CD19+ B细胞）中观察到相当的enAsCas12a-GFP表达水平（图1h）。这些数据证明了成功生成了两条条件性LSL-Cas12a品系和两条组成性Cas12a小鼠品系，且LbCas12a或enAsCas12a蛋白的长期组成性表达未引起可检测的毒性。

  

2. LbCas12a小鼠实现原代免疫细胞的多重基因敲除

作者利用LbCas12a小鼠展示了其在原代免疫细胞中进行多重基因编辑的能力。由于缺乏专门针对LbCas12a的crRNA设计算法，作者通过测试不同算法设计的向导RNA，发现Broad CRISPick算法（原本为AsCas12a设计）在筛选后可显著提升LbCas12a的crRNA功能性。通过筛选CRISPick设计的crRNA，其“目标切割百分比”参数达到40%或更高，crRNA的平均切割效率提高了2.49倍，72.9%的crRNA表现出成功的基因编辑能力。这表明该算法可用于预测LbCas12a的基因编辑效率。

 

作者进一步在多种原代免疫细胞（包括BMDCs、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和B细胞）中测试了基因编辑效果。通过开发一种带有mScarlet荧光蛋白报告基因的逆转录病毒向导递送系统，作者在这些细胞中实现了高效的单基因敲除，蛋白水平的敲除通过流式细胞术得到验证（图2a）。作者注意到，针对同一基因的不同crRNA之间的编辑效率存在差异（图2b-d）。DNA水平的基因编辑通过T7EI检测技术和NGS得到确认，结果与流式细胞术分析一致。

图2. 利用LbCas12a小鼠和enAsCas12a小鼠进行多重免疫细胞基因编辑。

 

此外，作者在单细胞水平上测试了同时敲除多个基因的能力。通过串联crRNA阵列，作者成功实现了CD24和CD43的双重敲除，其中双crRNA组中11.1%的细胞同时敲除了这两种蛋白（图2e）。另一组实验中，crCD24和crCD11c的双crRNA阵列实现了26.4%的单细胞水平双敲除（图2f）。这些结果表明，LbCas12a小鼠在原代免疫细胞中具有强大的多重基因编辑能力。

 

3. LSL-enAsCas12a小鼠实现原代免疫细胞的多重体外基因工程

作者评估了LSL-enAsCas12a小鼠在原代免疫细胞中进行多重基因工程的能力。作者在BMDCs和CD8⁺ T细胞中测试了双重基因编辑，通过流式细胞术检测高表达的表面标记（图2a）。为了诱导enAsCas12a表达，作者生成了一个带有Cre和mScarlet表达盒的新逆转录病毒载体（图2g）。在BMDCs中，DKO组合crCD24-crCD11c在细胞群体水平上平均诱导了79.2%的CD24蛋白敲除和62.9%的CD11c敲除，与SKO对照相当。在单细胞水平上，crCD24-crCD11c产生了高效的双重敲除，平均有53.5%的细胞为CD24⁻;CD11c⁻（双阴性）群体（图2h）。靶向测序显示，DKO组（crCD24-crCD11c）分别诱导了CD24和CD11c基因93.8%和86.5%的基因修饰（图2i）。

 

在CD80-H2Ab1的DKO实验中，crCD80-crH2Ab1组诱导了72.2%的CD80敲除和25.8%的MHCII敲除，平均有24%的细胞为CD80⁻;MHCII⁻（双阴性），表明在单细胞水平上实现了双重敲除（图2j）。靶向测序显示，DKO组crCD80-crH2Ab1在Cd80和H2Ab1中分别诱导了94.5%和90.1%的基因修饰（图2k）。在CD8⁺ T细胞中，DKO构建物crThy1-crCD27诱导了65.6%的THY1⁻;CD27⁻（双阴性）群体（图2l）。

 

图2. 利用LbCas12a小鼠和enAsCas12a小鼠进行多重免疫细胞基因编辑。

  

 作者还比较了LSL-LbCas12a和LSL-enAsCas12小鼠的多重基因编辑能力，发现LSL-enAsCas12a小鼠在单细胞水平上的双重敲除效率更高。因此，作者主要关注LSL-enAsCas12a小鼠进行后续的应用和表征。

 

4. 利用LSL-enAsCas12a小鼠进行高效的体内基因编辑

非病毒载体如脂质纳米颗粒（LNP）常用于体内基因编辑和治疗。作者通过静脉注射LNP-crRNA到组成性enAsCas12a小鼠体内，靶向小鼠Ttr基因（图3a），其人类同源基因是转甲状腺素蛋白淀粉样变性的治疗靶点。实验中，Ttr-cr1和Ttr-cr2两个向导RNA从注射后第6天开始显著降低血清TTR蛋白水平，且在20天监测期内保持稳定（图3b）。Ttr-cr1几乎实现了100%的血清TTR水平敲除，Ttr-cr2也达到了近50%的敲除效果。

这些结果表明，enAsCas12a-HF1小鼠结合LNP-crRNA递送系统，在体内基因靶向方面具有高效且具治疗相关性的潜力，为疾病模型中的直接体内靶向和递送研究提供了广阔的应用前景。

图3. 通过肝脏LNP-crRNA靶向和AAV介导的肿瘤发生展示的体内基因编辑。

 

5. LSL-enAsCas12a小鼠实现体内多重基因编辑用于自发性癌症建模

自发性癌症模型通过在完整生物体内从正常细胞直接诱导肿瘤，更接近人类肿瘤发生过程和微环境。传统方法构建基因工程小鼠模型过程繁琐，而CRISPR基因组工程，尤其是Cas9基因敲入小鼠及其病毒递送方法，简化了自发性癌症建模。然而，Cas9系统在肿瘤建模中因缺乏多重基因编辑能力和AAV载体包装尺寸限制而受限。Cas12a具有高多重化能力，可通过单个载体中的crRNA阵列编码多个crRNA靶向多个基因。因此，LSL-enAsCas12a小鼠成为更适应性强和精确的自发性癌症建模的高效工具。

作者从泛癌数据库中选择了六个经常发生突变的肿瘤抑制基因（TSGs），经过分析后选择了TP53、APC、PTEN和RB1。为了同时靶向小鼠的Trp53、Pten、Apc和Rb1，作者克隆了一个串联的RNA阵列（crTSG），由单个U6启动子驱动（图3d）。Cre重组酶在EFS启动子下表达，以激活enAsCas12a-HF1-eGFP表达。通过静脉注射AAV-crTSG-Cre，100%的小鼠在一个月内发展出侵袭性头颈部癌症，而对照组没有癌变（图3e）。肿瘤切片在免疫组化分析中显示出enAsCas12a-HF1-GFP表达，表明肿瘤是由AAV-crTSG-Cre介导的基因编辑诱导的（图3f）。

图3. 通过肝脏LNP-crRNA靶向和AAV介导的肿瘤发生展示的体内基因编辑。

 

作者进一步使用CODEX技术对SCC进行了表征，该技术能够在单细胞分辨率下进行多重蛋白质组学分析（图3h-j）。基于22个标记物的表达水平，SCC细胞被分解为17个簇。这些肿瘤区域表现出高度的异质性，与通过癌细胞系建立的异种移植肿瘤相比，这种模型在生理学上更接近人类肿瘤。总之，LSL-enAsCas12a小鼠展示了体内多重基因组工程的稳健性，使得自发性癌症建模成为可能。

6. 肿瘤和免疫细胞DKO样本的基因组分析

作者通过基因组水平的分析，量化了LSL-enAsCas12a小鼠的on-target和off-target效率。对鳞状细胞癌（SCC）样本进行的NGS显示，4个靶向肿瘤抑制基因（Trp53、Apc、Pten和Rb1）的基因修饰水平显著（平均约50%），且大多数修饰为缺失，集中在预测的enAsCas12a crRNA切割位点附近（图4a、b）。在单细胞水平上，10个肿瘤单克隆中有10个在两种癌症类型中都对所有四个基因进行了修饰（图4c、d）。

作者通过全基因组测序（WGS）和靶向扩增子测序来表征LSL-enAsCas12a小鼠在CD80-H2Ab1 DKO实验中的off-target率。WGS显示，DKO和SKO的独特变异在多个染色体上存在变异热点（图4e）。尽管WGS能够对整个基因组中的潜在off-target位点进行调查，但其测序深度有限。因此，作者采用靶向扩增子测序作为替代方法，其读取深度要高得多。结果显示，少数预测的off-target位点（crCD80_4、crCD80_10和crH2Ab1_10）上观察到修饰，但这些位点在载体组中也发现了修饰，表明这些indels可能由PCR偏差引起（图4f-j）。

这些结果表明，LSL-enAsCas12a在保持可控的off-target效应水平的同时，实现了高效的on-target多重基因编辑。

 

7. 利用LSL-enAsCas12a-HF1小鼠开发同时激活和敲除基因（DAKO）系统

为了在单个细胞中同时实现基因激活和敲除，作者开发了DAKO系统。通过将LSL-enAsCas12a-HF1小鼠与dCas9-SPH小鼠杂交，生成了LSL-enAsCas12a-HF1;dCas9-SPH DAKO小鼠（图5a）。

作者设计了一种Cas9–Cas12a融合向导RNA系统，该系统在单个序列中表达两种类型的CRISPR向导RNA（Cas9-sgRNA和Cas12a-crRNA），通过AsCas12a DR序列连接，用于在相同细胞中同时表达（图5b）。这种向导RNA嵌合体被enAsCas12a-HF1蛋白切割，生成成熟的Cas9-sgRNA和Cas12a-crRNA，分别指导dCas9-SPH进行基因激活和enAsCas12a-HF1进行基因敲除。

为了验证该系统，作者从DAKO小鼠中分离出BMDCs，并用携带DAKO融合向导盒（包含Itgb4-sgRNA与AsDR-crCD24连接）的逆转录病毒以及组成性活性EFS-Cre盒（sgItgb4-crCD24-Cre载体）感染它们（图5c）。

 

流式细胞术分析显示，sgItgb4-crCD24-Cre DAKO靶向在细胞群体水平上导致CD24蛋白减少，与单敲除对照相当（图5d、e）。同时，DAKO组中ITGB4蛋白在细胞群体水平上上调，表明基因激活成功。DAKO组中观察到预期的双重靶向细胞群体，其基因调控方向正确（图5d、e）。这些结果表明，DAKO系统能够在单细胞水平上实现高效且同时的基因激活和敲除，为免疫细胞中的正交双基因靶向提供了新的工具。

 

展望

解析复杂基因调控网络对于理解基础生物学和人类疾病的多效性至关重要。因此，开发一种多功能的体内和体外多重基因组工程技术是系统研究基因相互作用的必要条件。本研究成功培育了四种多功能小鼠品系：条件性LSL-LbCas12a和组成性LbCas12a小鼠，以及条件性LSL-enAsCas12a和组成性enAsCas12a小鼠。LbCas12a和enAsCas12a基因敲入小鼠及其配套的递送系统，可作为一套多功能的新型遗传工具。将多个crRNA整合到单个crRNA阵列中进行多重基因扰动，简化了克隆过程。作者发现，LbCas12a和enAsCas12a小鼠能够在多种免疫细胞类型中实现高达90-100%的高效基因编辑，并且在单细胞水平上展示了Cas12a小鼠的多重基因编辑能力。

为了兼容条件性和组成性enAsCas12a品系，作者开发并应用了多种递送方法（脂质纳米颗粒LNP、腺相关病毒AAV和逆转录病毒），分别用于高效的肝脏基因靶向、肿瘤建模和原代免疫细胞编辑。利用LNP-crRNA在一周内高效敲除了肝脏中的Ttr基因。通过同时敲除四个肿瘤抑制基因，迅速诱导了唾液腺鳞状细胞癌（SCC）。在原代BMDCs和CD8 T细胞中展示了高效的双重敲除（DKO），其效率高于LbCas12a小鼠。作者还通过与dCas9-SPH系统整合，开发了同时激活和敲除基因（DAKO）系统，展示了转基因小鼠的模块化能力。

本研究的组成性和条件性Cas12a小鼠品系能够高效地进行体内和体外多重基因组工程，为多种领域提供了应用机会。尽管由2A肽诱导的“自切割”效率还有待提高，但这些小鼠表现出与Cas9基因敲入小鼠相当的编辑效率，并且与Cas9小鼠相比，具有基于crRNA阵列的多重基因编辑的独特优势。这些小鼠可以促进体内治疗性基因靶向、疾病/肿瘤建模和原代免疫细胞工程的快速无缝工作流程。

结合寡核苷酸文库合成和克隆，这些小鼠可用于高通量CRISPR筛选，以研究复杂的遗传问题，例如免疫细胞中效应细胞和记忆细胞表型的转变。此外，这些小鼠允许构建多种肿瘤类型（如SCC和LUAD）的自发性肿瘤模型，或具有复杂基因型的肿瘤模型（例如，不同组合的肿瘤抑制基因的插入/缺失和染色体非整倍性）。作者注意到，在组成性Cas12a品系中，不同器官中Cas12a的表达水平存在差异。因此，在使用这些小鼠进行体内CRISPR筛选时，应考虑靶组织中Cas12a的表达水平。建议使用具有组织/细胞类型特异性的Cre驱动因子来驱动Cas12a的表达。开发其他变体的Cas12a小鼠，包括此处的两种Cas12a物种，以及敲入到不同安全港位点（如H11-enAsCas12a小鼠）的Cas12a小鼠，代表了为多样化应用领域开发广泛启用的Cas12a基因编辑工具包的汇聚性集体发展。