近日，把发NATURE当做家常便饭的CRISPR/Cas9基因编辑大神张峰又有重磅发现了，他所领衔的研究团队首次在真核生物中发现CRISPR样系统：一种名为Fanzor的蛋白，可以使用 RNA 引导机制，精确靶向和切割 DNA。经过系统工程改造优化后，未来Fanzor有望应用于新一代基因编辑器中。
张锋教授表示， CRISPR 系统功能强大，已被广泛使用，这是因为其容易被重新编程以靶向基因组中的不同位点。而该研究发现的新系统是对已有的基因组编辑工具的补充，是另一种对人类细胞进行精确改变的方法。
自从基因编辑系统被提出以来此领域就一直备受关注，其中最火热的莫过于CRISPR/Cas9，在2020年获得了诺贝尔化学奖，更是让基因编辑乃至整个基因治疗领域都大为振奋。今年6月，FDA受理首个CRISPR基因编辑疗法exa-cel上市申请。谷歌学术搜索关键词，仅 23年以来发文量居然已破万！为了发好文章的你是不是也开始跃跃欲试了呢？接下来就和小编一起简单了解CRISPR/Cas9的原理及其应用吧。
CRISPR/Cas9的工作原理
CRISPR/Cas系统是从原核生物中发现的一种防御外源性遗传物质入侵的自身免疫机制，主要分为三种类型:Type I、Type II和Type III。而常用的CRISPR/Cas9系统是由II型改造而来，具有核酸酶活性，并能够通过向导RNA的作用靶向性结合生物基因组任何区域的目的基因，进而实现对目标基因的编辑。
具体过程如下图所示，即在sgRNA的引导以及PAM序列的存在下，Cas9招募到靶DNA序列上，并利用HNH以及RuvC两个结构域对序列进行切割，断裂后的DNA片段可以通过两种方式对DNA片段进行修复，即易出错的非同源末端连接以及同源修复。利用前者，可以删除靶基因并进行大规模的功能缺失的筛选工作，而利用后者，可以在基因片段上插入感兴趣的基因。
CRISPR/Cas9的应用
1.基因功能研究
利用该系统的工作原理，可以人为调控基因的表达，达到基因改造的目的，并在研究基因功能的基础上，结合疾病模型筛选疾病相关基因以及药物靶标，为疾病治疗提供新的方案：
（1） 基因敲除
（2） 替换或突变
（3） 基因通路调控机制研究
（4） 药物靶点及抗药性机制研究
2.疾病模型构建
CRISPR/Cas9技术的出现，使得无需再使用相应物种的ES细胞系就可以制备基因编辑模式生物。通过CRISPR/Cas9技术构建动物疾病模型，有助于研究疾病发展的分子机理，为开发针对疾病的精准医疗方案奠定理论基础。
3.基因治疗
基因治疗(Gene therapy) 是指将外源基因导入靶细胞，修正或补偿由于基因异常或缺失导致的疾病的一种治疗方法。CRISPR/Cas9技术凭借其编辑效率高、可同时靶向多个靶基因等特点，已报道被用于肿瘤、神经退行性疾病、造血系统疾病和艾滋病等疾病的基因治疗。
4. 单碱基编辑器
传统的CRISPR/Cas9基因编辑技术虽然具有较高的基因敲除效率，但在进行特定的碱基替换时效率通常很低，这极大地限制了CRISPR/Cas9基因编辑的应用。近年来发展出的碱基编辑器（base editor）系统，可在不产生DNA双链断裂的情况下进行单碱基编辑，在由碱基突变造成的疾病治疗方面有较大的应用前景。
尽管CRISPR/Cas9能够实现基因表达调控的多种操作，递送始终是一个问题。目前，腺相关病毒（AAV）是体内基因治疗递送的主要平台。AAV安全、便捷，能够将单链DNA载体基因组递送至各种组织和细胞类型，并且在多种给药方式中仅具有弱免疫原性。通过腺相关病毒（AAV）递送CRISPR基因编辑工具，为开发永久性逆转致病基因缺陷的疗法提供了巨大潜力。
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客户研究案例精选
案例1
文献标题：Cas9-mediated replacement of expanded CAG repeats in a pig model of Huntington’s disease
文献期刊：Nature Biomedical Engineering，2023（IF=18.952）
客户单位：暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院
派真产品：AAV-mini-cmv-spCas9、AAV-controlgRNA-RFP 、AAV9-HTT-gRNA-RFP-20Q
实验对象：亨廷顿基因敲入猪模型
注射方式：脑立体定向注射或静脉注射
滴度：1.8 × 1013 vg
研究结果：该研究通过使用HD大动物模型，证明在大脑或外周静脉中单次注射AAV-CRISPR/Cas9可以有效减少神经退行性变并改善相关症状。亨廷顿疾病模型猪基因治疗的方式也为治疗其他神经退行性疾病提供了理论基础与新的思路。
案例2
文献标题：Engineered circular ADAR-recruiting RNAs increase the efficiency and fidelity of RNA editing in vitro and in vivo
文献期刊：Nature Biotechnology，2022（IF=54.908）
客户单位：北京大学
派真产品：AAV8-circ-arRNAs
研究结果：北京大学魏文胜课题组在研究RNA编辑技术中首次发现，只需转入一条特殊设计的RNA (arRNA, ADAR-recruiting RNA)，就能够通过招募细胞内源的ADAR1 蛋白对靶向基因转录本上特定的腺苷产生高效精准的编辑，且整个过程中并不需要引入任何外源效应蛋白。这种新型RNA 编辑技术被命名为LEAPER。
资料来源：
1. Saito, M., Xu, P., Faure, G. et al. Fanzor is a eukaryotic programmable RNA-guided endonuclease. Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06356-2. https://crisprtx.com/about-us/press-releases-and-presentations/fda-accepts-biologics-license-applications-for-exagamglogene-autotemcel-exa-cel-for-severe-sickle-cell-disease-and-transfusion-dependent-beta-thalassemia
3. Jiang F, Doudna JA. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annu Rev Biophys. 2017 May 22;46:505-529. doi: 10.1146/annurev-biophys-062215-010822. Epub 2017 Mar 30. PMID: 28375731.
4. Shi MG, Shen ZY, Zhang N, et al. CRISPR/Cas9 technology in disease research and therapy: a review. Chinese Journal of Biotechnology, 2021, 37(4): 1205-1228.