泊洛沙姆
泊洛沙姆一种是a -b – a型三段嵌合共聚物表面活性剂，具有疏水性聚丙烯氧化物(PPO)中心和两个亲水性聚乙烯氧化物(PEO)尾部。泊洛沙姆家族包含50多个成员，分子量从1.600到14.600 Da不等，PPO的百分比从15%到86%不等。它们具有不同的物理化学性质，如室温下的物理形态(液体、糊状或固体)。自20世纪50年代发明以来，泊洛沙姆已成为一类重要的非离子聚合物表面活性剂，具有广泛的工业应用。
泊洛沙姆P188是常用的泊洛沙姆产品之一，平均分子量为8400 Da, PEO含量在80%左右，以各种品牌名称而闻名，如PluronicVR F68. LutrolVR F68和Kolliphor VR P188.具有亲水性-亲脂性平衡(HLB)值，可将表面张力降低至50 dyn/cm左右(0.1%水溶液，室温)。与传统的小分子表面活性剂相比，泊洛沙姆聚合物的胶束化非常复杂，这是由于其具有两个长亲水尾巴的结构灵活性和多分散性。尽管在过去的几十年对泊洛沙姆有着大量的研究，但其在液体体系中的行为，包括胶束化和对温度影响，仍然不是很清楚。P188在室温下的临界胶束浓度(CMC)很难测量。一般情况下，37℃时P188的CMC范围为24 – 32mg /mL。
工艺流程
泊洛沙姆的聚合过程首先以水溶性丙二醇为引发剂，然后加入碱性催化剂如氢氧化钠或氢氧化钾进行氧烷基化反应。当催化剂固体完全溶解并充分混合后，再加入环氧丙烷(PO)进行增殖。当分子量增加到750da以上时，反应将使化合物不溶于水。然后加入环氧乙烷(EO)，使分子变回水溶性。最后，加入磷酸或乙酸等酸来终止反应，从而获得泊洛沙姆聚合物。
用途
在搅拌式生物反应器进行细胞培养过程中，通常会向培养体系中通入不同气体来维持反应器内的DO和CO2分压，一方面气泡上浮到培养液体表面破裂时会严重损伤细胞，另一方面反应器搅拌时产生的湍流的剪切力也是细胞损伤的原因。P188被广泛用作细胞培养过程中的剪切保护剂，以保护细胞免受生物反应器环境中的湍流影响，在防止细胞受到流体动力损伤方面有比较明显效果。细胞培养基中使用泊洛沙姆P188的典型浓度为0.5-3.0 g/L。据报道，浓度增加到5 g/L不影响细胞培养性能和产品质量。虽然P188保护功能的机制仍存在较大的争论，但大多数实验表明，它能够减少细胞与气泡的附着或改变细胞膜的流动性。
面临的问题
细胞培养基的组分是治疗性重组蛋白制品生产过程中常见的杂质来源，它们将影响工艺性能或药品质量。这些杂质包含培养基的原材料，如化学介质、无机盐、乳化剂、氨基酸和其他有机添加剂、微量金属元素成分等。而这些培养基原材料供应商的CoA主要基于药典的固定检测项目，因此不足以评估原材料差异及其对生物制造的影响。就如泊洛沙姆P188作为细胞培养基的一种原料，传统的检测方法尚不足以检测到其影响细胞生长的杂质的批间差异。近年来，P188批次之间的差异和对细胞培养性能的负面影响在供应商和生物制药领域引起了广泛的关注。虽然目前研究者对泊洛沙姆P188导致细胞培养批间差的根本原因尚不清楚，最近的一项研究报道表明，泊洛沙姆的所致细胞培养低性能不是由于毒性，而表现为保护细胞效率低下(Peng et al.， biotechnology Prog. 2014; 30:1411-1418)。实验中研究者添加非常低水平的其他表面活性剂也会干扰到P188.导致其对细胞的保护效率下降。
另外，有研究者开发了一种使用挡板摇瓶的简单筛选方法，在多个细胞系中进行了测试，其中4个批次的泊洛沙姆P188中有2个批次对细胞生长和活力有负面影响。尽管可以这种测试方法来降低风险，但为了更好地控制该原料，就需要对低性能批次相关机制有更好理解。
原因
经过研究，人们认识到泊洛沙姆的杂质存在对细胞活力有深远的影响。其所含的杂质可能来自于P188合成过程中的副产物，也可能是其生产制备的原料中携带进入或储存过程中的降解引入：
泊洛沙姆P188不是一种纯的化合物，是通过聚合反应生产出来的，其分子量的分布取决于制造工艺和过程控制。可能是在反应开始时环氧丙烷重排成烯丙醇，使得最终产物中含有少量的不饱和单羟基聚合物(a – b嵌段)，被认为是聚合反应中的杂质。
另一方面，泊洛沙姆P188对自氧化很敏感，在生产工艺中，通常添加丁基羟基甲苯(BHT)作为抗氧化剂。PEO经过过氧化分解后可生成甲醛和甲酸，而PPO可形成乙醛和乙酸等杂质。Gallet等人已经证实PPO基团的热稳定性较差，会发生六环分子内分解反应，形成过氧化氢等杂质。
该研究者进行了系统的调查，了解细胞培养应用中泊洛沙姆不同批次表现不好的根本原因，研究者们考察了不同分子量和疏水性表面活性剂的干扰作用;泡沫稳定性与细胞培养性能的关系;用喷淋/发泡的预处理方法，以改善可疑批次的性能。另一方面，在不同的分析方法下，比较了高性能和低性能P188批次之间的差异，重点关注于色谱分析中的高分子量(HMW)区域，证明了即使高性能批次的P188也含有高分子量（HMW）物质，但它们不具有表面活性，因此不影响P188的功能。然而，由于P188的复杂性，它在生物反应器环境(如气泡或细胞表面)中的定量分布尚未报道。从SEC的分析可以看出，P188是多种不同分子量聚合物的混合物，每种物质的确切结构和疏水性尚不清楚。每种物质及其相互作用对细胞的整体保护功能的重要性也是未知的。采用核磁共振(NMR)、表面张力、质谱、近红外光谱(NIR)和拉曼光谱等多种分析技术研究P188批次的变化表明，并非所有的结果都与批间差异有很好的相关性。
另有研究者证明，泊洛沙姆P188中的HMW物质PPG2000可能是影响细胞培养性能异常的原因，研究结果显示，当PPG浓度大于20ppm时，将显著影响细胞生长及乳酸代谢。
鉴定
SEC被证明是检测P188中HMW物质存在的一种极好的方法。采用PLS模型建立SEC检测到HMW种数与细胞培养中观察到的活力下降之间具有相关性，R2为0.85.
此外，采用SEC法鉴定泡沫层中P188与液体层中P188的差异。P188在泡沫层中的富集被用作疏水性的间接指标。研究表明，低性能批次的泡沫层比高性能批次的泡沫层含有更多的HMW物质。有趣的是，高性能批次的HMW物质分子大小在15.200 – 19.200 Da之间，没有太多的表面活性。
结论
研究者(Peng et al.， biotechnology Prog. 2014; 30:1411-1418)的研究结果显示泊洛沙姆P188的性能与其泡沫稳定性非常相关。在隔板摇瓶中，由于泡沫层中的成分不同，低性能批次产生的泡沫持续时间较长。在泡沫稳定性实验中，向不同批次的P188中加入消泡剂，在摇了一夜之后，不同批次的P188都有相当数量的泡沫形成。当停止摇动时，高性能批次P188的泡沫破裂，性能较差批次的P188泡沫仍然稳定存在，用这种方法可以分辨出低性能P188批次。
与Murhammer和Goochee报道一致，高分子量(HMW)的物质导致了过度的泡沫形成。隔板摇瓶模型有助于分离泡沫层中的高分子量和高疏水性物质，可用于纯化泊洛沙姆。在去除低性能批次的泡沫层后，细胞培养性能得到改善。
总之，高分子量（HMW）和高疏水性的物质与P188性能的下降有高度的相关性，可以通过发泡和SEC实验相结合来检测。泡沫分离方法也可作为一种潜在的缓解策略，用于预处理泊洛沙姆P188材料。