GMP级AAV常见问题解答
Q: pH值测定是检测浓缩之前还是浓缩之后的pH？浓缩前后的pH是否会变化？如果是浓缩后，用pH计测定需要的样品量较多，是否会导致浪费？
A: pH值是rAAV成品放行必检项，如果希望节约样品，建议采用微量pH电极来实现，样品量一般仅需15uL-100uL。
Q: 装量怎么理解？
A: 按照药典通则0942，最低装量检查法进行标示装量的检测。如有变动，建议与CDE沟通。
Q: A260/A280反映的是DNA/蛋白的相对比值，它具体有什么意义？
A: A260/A280是DNA/蛋白的直观体现，对于rAAV而言，该指标可以侧面反映空壳率或者其他污染。当A260/A280过小，则空壳率可能偏高，当A260/A280过高，则其他污染可能过高。该方法的检测的优点是方便快捷，便于趋势跟踪。
Q: 一般来讲，蛋白杂质均来自宿主细胞和培养基，如果已经检测了宿主蛋白残留和BSA，再单独检测蛋白杂质又是基于什么考虑？
A: SDS-PAGE检测蛋白的目的是鉴别rAAV的衣壳蛋白条带，也能总体直观地反映蛋白杂质情况，除了宿主蛋白、BSA外，蛋白也可能是衣壳降解产物。
Q: 像rAAV这种非整合宿主基因组的病毒载体，如何检测感染滴度？
A: 目前检验的金标准是采用TCID50，基本原理是基于辅助病毒adenovirus H5细胞实验再采用qPCR检测。
Q: 检测基因的表达和功能，考虑到之前已经用相同的质粒包rAAV完成体外实验和小鼠实验，所以这两项算是做过了，只要DNA序列正确，基因表达和功能检测可以不做吗 ？
A: 基因表达跟工艺稳定性有关，也是属于效价（potency）的重要项。至于功能检测，建议与CDE沟通，从科学性角度做验证。
Q: rcAAV是否指双链互补AAV？我的AAV非自身互补，不知检测该指标是基于什么考虑？
A: rcAAV是指复制完整型AAV（replication competent AAV），是对具有复制能力的AAV做残留限定，也是法规要求的重点项目，从评审的角度涉及安全性的检验项目是重点关注的项目。
Q: 不溶性微粒，不知这项中的不溶性微粒与外观可见异物和可见异物项目有何区别？
A: 外观可见异物的检验方法是目测法，主要标准是无50μm以上异物，可见异物系指存在于注射剂、眼用液体制剂和无菌原料药中，在规定条件下目视可以观测到的不溶性物质，其粒径或长度通常大于50μm，此项目针对所有液体制剂【参引药典通则0904】。
不溶性微粒的检验方法通常采用不溶性微粒仪，关注的微粒范围为含10μm及以上的微粒。针对检查静脉用注射剂（溶液型注射液、注射用无菌粉末、注射用浓溶液）及供静脉注射用无菌原料药中不溶性微粒的大小及数量，可根据自己项目性质进行评估。【参引药典通则 0903】
Q: 对于支原体和细菌内毒素，是基于安评的考虑，之前已经做了两批小鼠实验，结果都没问题，这两项是否可以不做？
A: 基因治疗国内法规参见CDE颁布《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》需进行该支原体、内毒素的检验。如有疑问，建议与中检院、CDE做沟通。
Q: 派真HEK293细胞的来源？
A: 派真HEK-293细胞是获得商业授权的，建议客户根据自身项目的特点进行病毒产毒能力的评估之后再做选择商业。
Q: 派真生物单次发酵的生产体积？对应的AAV产量是多少？
A: 单次贴壁发酵体积：1L, 5L, 25L, 50L, 200L，均为单个反应器。不同AAV血清型和不同载体基因的产量可能不同，以AAV9（以中高产血清型为例）， 1L产量约1E+14GC，50L约1E+16GC，100L约2E+16GC，建议完成必要的工艺开发和批次稳定性验证。
Q: Genome copy/mL（GC/mL）与 vg/mL（virus genome/mL）的单位是否具有换算关系？派真测定腺相关病毒GC/mL是采用何种方法？如果是q-PCR，是采用病毒自身特异引物，还是采用插入表达序列特异性引物？
A: enome copy/mL=gc/ml= vg/mL（virus genome/mL）。测定GC采用q-PCR和ddPCR两种方式。qPCR涉及标曲标准品的标定；ddPCR可以设置参比品质控，非必需项。ddPCR在精密度的验证上%RSD更低，特别是中间精密度。qPCR更容易存在实验室间与操作人员间的偏差。工艺摸索和中间品主要采用qPCR，终特色服务的滴度通常用ddPCR。GC方法开发可采用GOI靶基因的特异性引物，前期开发阶段也可采用polyA或者ITR等元件作为通用型检测。
GMP特色服务建议用特异性引物，终特色服务滴度检验均基于特异性引物检验放行的。
Q: 对于包装生产的腺相关病毒成品，有否对空壳率进行测定，用什么方法，空壳率维持在一个什么样的水平？
A: 通常采用AUC、TEM、CyroTEM、或者VG TITER/CAPSID TITER，但是AUC、TEM、CyroTEM不适合作为QC放行用，用于质量研究和工艺开发用会更好。目前采用阴离子色谱HPLC进行方法开发，派真可以提供分析方法开发服务并与CyroTEM、AUC检验结果进行比对验证。
空壳率每个血清型用柱层析得到的空壳率都有不同，派真生物生产AAV9可以通过工艺优化控制在10%以内的水平。
Q: 细胞库的检定是否按照中国药典2015三部通则《生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程》进行？
A: 是的
Q: 通用检项中未见HIV，HBV，HCV检测，无热原质试验，野毒检测，这些是否需要检测，但是不属于通用检项？
A: 特色服务收获液会根据工艺特性进行外源病毒因子检测，不列入原液和成品标准中。
Q: 目前分析方法可接受的误差或偏差范围？
A: 一般生化类方法的%RSD通常为15%-25%，ddPCR接受标准为70%-130%，但通常验证数据为＜5%，TCID50的%RSD为小于100%。
Q: 对于批次送检的样本，有什么送样量的要求吗？
A: 建议单次委托快递送样量不低于50uL体积，避免冻融、蒸发、管壁的影响。基因组滴度、质粒DNA残留、rcAAV等建议送样量10ul以上，感染滴度送样量建议20 ul以上，检测空壳率的送样量建议达到5×1013vg。