科研级AAV常见问题解答
Q: 什么是AAV?
腺相关病毒（AAV）是一种单链DNA病毒，目前的科学界共识是它不会导致任何人类疾病。它由蛋白衣壳（capside）和长度为4.7kb的单链DNA基因组构成。蛋白衣壳由三个亚基组成，分别为VP1，VP2，和VP3。AAV基因组两端为两个“T”型的末端反向重复序列（inverted terminal repeat, ITR）。这两个ITRs是病毒DNA复制的起点和触发病毒包装的信号。
作为基因疗法载体的重组腺相关病毒（rAAV）携带的蛋白衣壳与野生型AAV几乎完全相同，然而衣壳内的基因组中编码病毒蛋白的部分完全被删除，取而代之的是治疗性转基因（transgene）。AAV基因组中唯一被保留的部分是ITRs，它起到指导基因组的复制和病毒载体组装的作用。将编码病毒蛋白的部分完全删除的优点是：一方面可以最大化重组AAV携带转基因的容量，另一方面减小体内递送转基因时产生的免疫原性和细胞毒性。
rAAV在感染细胞后会头尾相连形成环状，能长期存在而不被细胞系统当作外源DNA降解，因此可以在哺乳动物器官或组织中长期保留，并且只有极低的整合基因组机率。这个特性使AAV成为基因治疗的首选载体，也同样成为科学研究中在动物体内传递外源基因的一个优异载体。
AAV作为新一代基因治疗载体，还有一个很重要的特性在于其特异性强。得益于AAV的不同血清型，每种血清型对不同的脏器有较高的识别及感染能力，配合以合适的注射方法，会取得更好的效果。如果您做动物实验，建议首选AAV。
Q: rAAV作为基因传递载体，包装外源序列的上限是多少？
rAAV的基因组包装上限约为5Kb，除去两端ITR序列各145bp，则能容纳4.5Kb的外源序列；即：启动子+外源基因+终止信号的总长度不能超过4.5kb;派真的K104载体提供了目前最小的广谱启动子miniCMV(CMV的核心区域,180 bp)及终止子（50 bp）表达盒，可表达约4.4Kb长度的基因，已是能包装基因长度的极限。
Q: scAAV和ssAAV的区别
双链AAV（scAAV）感染后2~3天表达水平可到达峰值，单链AAV（ssAAV）感染后表达到达峰值的时间需要约7天；因为单链AAV进入细胞后必须变成双链DNA才能转录和翻译外源基因，这个过程非常缓慢；双链AAV（scAAV）感染效率比单链AAV(ssAAV)有6-15倍的提高；相同的滴度，双链AAV（scAAV）的生产规模需要比单链AAV（ssAAV）的生产规模大，所以双链AAV的包装价格更贵一些。
Q: rAAV滴度单位GC/ml代表什么？如何检测？
GC代表genomic copies，基因拷贝数；GC/ml表示每ml病毒液的病毒颗粒中含有的基因组拷贝总数；派真生物采用SYBRgreen 荧光定量PCR检测AAV的滴度，同时用ATCC标准品校正；特异性PCR引物是针对ITR区；派真生物提供的滴度是1E+13GC/ml以上； V.G./ml：Vector Genomes/ml的缩写，也是表示AAV病毒载体的滴度，等同于GC/ml。也是指每ml病毒液中含有的基因组拷贝数。通常用点杂交（dot-blotting）方法、QC-PCR方法、real time-PCR方法来测定。通常在测定前对样品用DNaseI处理，因此该滴度表示方法一般指每ml病毒液的病毒颗粒中含有的基因组拷贝总数。
Q: rAAV有哪些血清型？如何选择合适的血清型？
现阶段已经发现的AAV有10多种血清型（AAV1/2/3/4/5/6/7/8/9/PHP.eB/PHP.B/PHP.S/rh10/DJ/2-retro）以及多种突变型。由于cap衣壳蛋白的氨基酸序列和空间结构的不同，识别与结合的细胞表面受体也有很大的差异，所以导致不同血清型AAV感染的细胞和组织类型和感染效率也各不相同。
文献中对各组织的AAV血清型感染能力可能存在不同结果，对于文献数据较少的靶组织，建议研究者用预实验测试确定最理想血清型，这也将是实验创新点之一。
细胞感染：AAVDJ（感染80%的细胞类型）和AAV6（感染血液来源的细胞）
Q: 客户定制服务项目（AAV载体构建）需要了解哪些信息？
① 客户是否有基因模板？如果有模板，需要测序验证之后提供给我们；
② 如果客户没有模板，需要合成基因？基因号、序列图谱、物种、基因长度；
③ 构建用什么启动子、需要添加什么标签或者荧光标记，是否要求几个基因共表达；
④ 注意AAV载体ITR之间的容量；
⑤ shRNA建议客户选择三个靶点，或者选择一个经过验证的靶点;我们帮忙设计的话，不保证感染效率，建议客户可以先用构建好的质粒在体外筛选一个最佳的感染靶点，再进行AAV病毒的包装。
Q: 客户定制服务项目（rAAV病毒包装服务）需要了解哪些信息？
① 根据感染的部位推荐不同的血清型；如果客户不确定血清型，可以参考相关文献；或者申请我们的不同血清型的荧光对照试用装进行筛选，再确定最佳的血清型；
② 如果客户自己提供质粒进行包装，需要客户提供载体图谱序列，确认载体是不是AAV载体，确认载体的ITR间距；跟客户确认质粒是否经过测序验证；
③ 确认客户的AAV病毒包装信息属于那一类型：A类、B类、C类、D类；
④ 确认需要包装的rAAV病毒的总量、滴度、分装要求。
Q: AAV纯化的方法及QC检测指标有哪些？
派真生物采用碘克沙醇 密度梯度离心的方法进行纯化；
派真生物的QC检测指标：
(1). 纯度：通过跑SDS-PAGE考马斯亮蓝染色观察纯度；
(2). 滴度：派真生物用ATCC标准品做校正，用SYBR Green QPCR检测滴度，最后滴度可以达到1E+13GC/ml以上；
(3). 内毒素检测：内毒素含量不超过10EU/ml;
(4). TEM电镜（可选项目）：通过电镜观察空壳率（Empty/Full Ratio），低于30%以下；
(5). HPLC（可选项目）：检测纯度；
(6). 质谱分析（可选项目）：确定AAV血清型；
(7). ddPCR检测滴度（可选项目）：没有标准品校正。