rAAV的应用

腺相关病毒（AAV）是哺乳动物最安全的基因传递载体之一，因为与腺病毒相比，它需要辅助病毒进行传播并产生相对温和的先天性和适应性免疫反应，这可能会引起严重的免疫反应。目前用于研究的重组AAV（rAAV）具有临床安全性，因为它在目标序列的两端都包含AAV包装信号序列（反向末端重复序列，ITR），此外还缺少编码AAV蛋白Rep和Cap的基因。它在受感染的细胞中形成游离连接体，几乎不整合到宿主基因组中。 1984年，第一个rAAV载体被证明能够将外源基因传递到哺乳动物细胞中。从那时起，rAAV被用作生物学研究和后来的临床基因治疗中的基因转移载体。

rAAV作为研究工具

体内过表达

rAAV首先用于将新霉素抗性基因传递到哺乳动物细胞中。之后，rAAV被用作基因转移工具用于研究。通过rAAV在哺乳动物细胞中过表达靶基因具有独特的优势。例如，rAAV可以在体内不进行基因组整合的情况下获得长期表达，而慢病毒虽然可以长期表达基因，但组织嗜性有限，引起了对基因组整合的关注。腺病毒是瞬时表达载体，但它经常引起严重的免疫反应，这可能影响或隐藏转基因的正确表型。相反，rAAV可以根据不同的血清型和启动子特异性将靶基因转移到动物的几乎所有组织中。在认识到互补的AAV的互补第二链的合成是体内转导效率的瓶颈之后，McCartyy及其同事发明了一种双链（自互补）AAV，其含有无法被Rep蛋白切割的修饰的ITR。 ;反过来，自互补单链DNA可以形成双链DNA [1]。我们生成了具有14种启动子的“ K”系列ssAAV入门载体，用于靶向通用或特定器官或细胞类型，以及具有12种启动子的“ KD”系列dsAAV（scAAV）来驱动定制基因。

体内敲除

rAAV与CRISPR结合，最近已在几种情况下用于体内基因敲除。 Zhang和他的同事向C57BL / 6小鼠注射了携带肝脏特异性启动子驱动的靶向PCSK9基因的SaCas9的rAAV8，将其敲除效率提高了50％，血清Pcsk9降低了95％。三组成功使用rAAV9递送SpCas9 / SaCas9系统跳过了DMD小鼠可忽略的突变外显子23的40％，并将肌肉功能显着恢复到治疗水平。此外，天普大学的研究人员首次展示了通过rAAV9体内消除小鼠基因组中的HIV-1 DNA的作用，该rAAV9可在血细胞，脑，心脏，肾脏，肺，脾脏和肝脏等多个器官中传递CRISPR / Cas9和sgRNA序列。肝。 PackGene Entry载体的序列“ A / B / C / D / F / G / H”包含7种类型的CRISPR / Cas及其变体，包括SpCas9，SpCas9HF，SaCas9，SaCas9HF，NmCas9，AsCpf1和LbCpf1。所有PackGene Entry载体均配备了优化的gRNA支架和哺乳动物或人类密码子优化的CRISPR / Cas。

体内激活

体内敲降

rAAV作为基因治疗的临床试验载体

来自佛罗里达大学的Flotte等最先在临床试验中使用rAAV纠正遗传性疾病囊性纤维化[2]。编码氯离子通道的囊性纤维化基因的丢失会导致慢性肺部感染，肺气肿并缩短寿命。由于rAAV的能力相对较小，他们依靠ITR的弱启动子活性，并将无启动子的CFTR基因插入rAAV。该载体用于转导鼻或肺气道上皮细胞。该首次试验证明了载体的安全性，并显示了取决于靶组织的不同转导功效。

rAAV的第一个临床成功来自几个使用rAAV-rpe65治疗纯合性隐性rpe65缺乏症引起的先天性黑ber病（LCA）的小组[3]。在将rAAV-RPE65视网膜下注射入每位患者的一只眼睛后，其中一些患者的视力明显恢复。

目前，全世界已经完成或正在进行200多次临床试验。
有关rAAV临床试验的完整列表，请单击下面的Web链接。
http://www.genetherapynet.com/clinical-trials.html

参考文献